疏肝健脾方不同提取工艺对化学性肝损伤的保护作用

　　肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理状态，具有发病率高、病程长、难治愈、易反复等特点，严重危害到人们的身体健康。疏肝健脾方(又名肝乐颗粒、肝乐冲剂) 依据"见肝知脾，知肝传脾，当先实脾"理论创制而成，具有疏肝解郁、健脾渗湿、活血化瘀之功效，用于急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化活动期，临床疗效确切。本研究采用一次性腹腔注射 0． 1% 四氯化碳复制肝损伤小鼠模型，观察疏肝健脾方不同提取工艺对其的保护作用。

　　1、 材料与方法

　　1． 1 试验药物 药材源于安徽中医药大学第一附属医院草药房，经孟楣主任中药师鉴定为正品。疏肝健脾方水提物: 按照处方比例，精确称取茵陈，板蓝根、薏苡仁等药材重量，加 8 倍量水煎煮 2 次，每次 1h，合并两次水煎液浓缩成浸膏，备用。疏肝健脾方醇提物: 精确称取上述药材，加 8 倍量 80% 乙醇煎煮 2 次，每次 1h，减压蒸去乙醇浓缩成浸膏，备用。疏肝健脾方醇水双提物: 精确称取上述药材，第一次加 8 倍量 80% 乙醇煎煮 1 小时，过滤煎液; 第二次加 8 倍量水煎煮 1 小时，过滤煎液，合并两次滤液，浓缩成浸膏，备用，不同提取物浸膏得率如表 1 所示。

　　联苯双酯: 北京协和制药厂产品。

　　1． 2 动物 昆明种小鼠，体重 20 ± 2g，雄性，由安徽省实验动物中心提供，许可证号: SYKK(皖) 2012 -002，SPF 级。

　　1． 3 试剂 四氯化碳(CCl4) ，天津市富宇精田化工有限公司;丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT) 、天冬门氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST) 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px) 试剂盒，南京建成生物工程研究所; 兔抗鼠 NF-κB、TNF-α 单克隆抗体、DAB 显色试剂，河北博海生物工程开发有限公司。

　　1． 4 仪器 GL-20A 全自动冷冻高速离心机，湖南仪器仪表总厂离心机厂; BIOＲAD680 酶标仪，美国伯乐公司。

　　1． 5 方法 小鼠适应性饲养一周后，随机分为正常对照组、模型组、疏肝健脾方水提、醇提、醇水双提(15． 6g/kg) 组和联苯双酯(BP，0． 1g/kg) 组，每组 10 只。灌胃给予不同工艺制备的提取物，每天 1 次，连续 10d，正常对照组和模型组给予等量溶媒。末次给药 8h 后腹腔注射 0． 1%CCl4橄榄油溶液(10ml/kg) 复制化学性肝损伤模型，16 小时取样。

　　1． 5． 1 肝脏病理组织学观察 取固定部位肝组织，置于 10 %福尔马林液中固定，48h 后常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE 染色、脱水、透明、封片，普通光学显微镜下观察病理组织学改变。

　　1． 5． 2 血清 ALT、AST 的含量 血清 ALT、AST 含量采用分光光度计法测定，严格按试剂盒说明书的操作步骤进行操作。

　　1． 5． 3 肝组织 SOD、MDA、GSH-Px 的含量 取肝脏组织，用冷生理盐水洗去浮血，拭干，称取 0． 3g 肝组织，制成 10% 的肝匀浆。进行 SOD、MDA、GSH-Px 含量的测定，具体遵照说明书进行。

　　1． 5． 4 肝组织中 NF-κB、TNF-α 的表达 采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复，S-P 法免疫组织化学染色，用 DAB/H2O2显色，苏木精复染。具体操作按试剂盒说明书，用已知阳性切片作为阳性对照，用 PBS 代替一抗作为阴性对照，具体遵照说明书进行。

　　2、 结果

　　2． 1 疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠肝脏病理组织学改变的影响 HE 染色显示，正常组肝细胞结构清晰，肝细胞核大而圆，核膜清晰，核仁明显，胞质丰富; CCl4模型小鼠细胞核断裂，肝细胞呈较广泛的嗜酸性坏死，肝细胞肿胀较明显，脂肪变性，形成空泡; 疏肝健脾方各组和 BP 组均可减轻病变程度与范围，提示对化学性肝损伤小鼠具有一定的保护作用，结果见图 1。

　　2． 2 疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响 CCl4诱导的模型组血清 ALT、AST 含量明显升高，与正常组相比，差异具有显著性; 而给予的疏肝健脾方不同提取物和 BP 组血清中 ALT、AST 水平明显得到降低，结果见表 2。

　　2． 3 疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠肝匀浆 SOD、MDA、GSH-Px 水平的影响 与正常组相比，CCl4诱导的模型组肝匀浆 MDA 含量明显升高，而 SOD、GSH-Px 含量显著降低，给予疏肝健脾方各组干预 10d 后，可显著降低肝匀浆 MDA 水平，升高 SOD 和 GSH-Px 水平，结果见表 3。

　　2． 4 疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠肝组织中NF-κB、TNF-α 蛋白表达的影响 NF-κB 和 TNF-α 蛋白免疫组化染色以棕黄色或深棕黄色为阳性表达，主要分布在肝细胞的胞质和/或胞浆。正常肝组织中 NF-κB、TNF-α 少量表达; 模型组中 NF-κB、TNF-α 广泛表达，疏肝健脾方不同提取物组表达明显减弱，阳性面积明显减小，表明疏肝健脾方各组均可抑制 NF-κB、TNF-α 活性，结果见图 2、3。

　　3、 讨论

　　CCl4诱发的化学性肝损伤模型，是常用的经典肝损伤病理模型之一。CCl4通过破坏肝细胞及其内膜机构，损坏肝细胞，致使胞浆中的酶如 ALT、AST 等释出入血。因此，血清中ALT 和 AST 水平高低可敏感地反映肝损害的程度。本研究发现 CCl4诱导的模型组小鼠肝细胞呈较广泛的嗜酸性坏死，肝细胞肿胀较明显，ALT、AST 含量明显升高，表明模型复制成功。

　　给予疏肝健脾方不同提取物干预后，肝组织损伤程度明显减轻，肝功能得到显著改善，提示疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠具有一定的保护作用。脂质过氧化在化学性肝损伤中具有重要的作用。SOD是人体内最重要的自由基清除剂，能清除超氧阴离子自由基，保护生物膜免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。MDA 是脂质过氧化最终产物，其含量与脂质过氧化程度成正比。GSH-Px 是机体重要抗氧化酶，它可以催化H2O2还原成水，在这一反应中，GSH 可作为供氢体参与反应，阻断了超氧阴离子通过中间体 H2O2生成高活性的膜过氧化剂·OH 的途径，从而保护细胞免受氧自由基的毒性损害。本研究发现疏肝健脾方不同提取物可升高 SOD、GSH-Px 含量，降低MDA 含量。

　　NF-κB 是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子，能介导多种炎性介质转录表达，参与了细胞凋亡的调控，还能促进TNF-α 等因子在急性肝损伤中的表达。肝脏是产生 TNF-α的主要器官，可诱导氧自由基的产生及脂质过氧化，从而导致肝损伤。本研究表明疏肝健脾方不同提取物可明显抑制 NF-κB、TNF-α 蛋白的表达。综上所述，疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠具有一定的保护作用，以醇水双提物效果最为显著，其机制可能与增强机体抗脂质过氧化有关。

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