3β-羟基-孕甾-5-烯-20R-胺的合成与结构解析

　　甾体母核是激素类药物的基本结构，也是一个很好的新药研发平台[1-3]。对甾体进行结构改造所得到的化合物大多具有很好的生理活性[4，5]。Khan S N等[6]合成了一系列的 7-氟代-3-胺基甾体，结果表明合成的化合物对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、酿脓链球菌和大肠杆菌有高效的抑制作用。Jegham H等人[7]合成的一种新胺基甾体（RM）表现出广谱抗肿瘤的作用，对 9 种癌细胞系有抑制作用，RM 能阻断HL-60 细胞周期的 G0/G1 期。氨基甾体化合物能有效地抑制白血病细胞 K562、MEG-01、WEHI-3B 和HL-60 的增殖，促进细胞凋亡并诱导分化[8，9]。21-氨基甾体化合物具有良好的抗脂质过氧化作用，可治疗心脑血管系统和中枢神经系统疾病[10]。甾体内酰胺和硫代甾体内酰胺化合物可以抑制人宫颈癌（Hela）细胞的增殖，体外实验表明其抗增殖活性呈明显的剂量依赖关系，并且对肿瘤细胞的作用具有选择性[11]。现利用甾体酮肟[12]还原法得到了 20R-胺基甾体，并利用 2D NMR 技术对其进行结构解析和碳谱、氢谱数据归属，为其活性测定起到参考作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　妊娠烯醇酮、盐酸羟胺、镍铝合金粉、氢氧化钠、浓盐酸等，实验所用各种试剂均为分析纯。

　　1.2 主要仪器

　　RE52-99 旋转蒸发器（上海精密仪器仪表有限公司），TH-I 型薄层加热器（上海科哲生化科技有限公司），所有 NMR 实验在 Bruker AVANCE DPX-400超导核磁共振仪上进行，样品以 DMSO-d6为溶剂，TMS 为内标。

　　1.3 方法

　　将 1.10 g（3.48×10-3mol） 的妊娠烯醇酮（1）与0.99 g 的盐酸羟胺置于 50 mL 的圆底烧瓶中，用 95%乙醇完全溶解后，加入 2.25 mL 吡啶，室温下搅拌反应 3 h。反应完全后，向反应体系中加蒸馏水 25 mL，搅拌 10 min，析出白色固体。抽滤，真空干燥，得产物3β-羟基-孕甾-5-烯-20-酮肟（2）1.09 g。

　　将 2.0 g（6.04×10-3mol）的妊娠烯醇酮肟（2），置于 500 mL 的圆底烧瓶内，加 60 mL 的无水乙醇溶解，再加入 60 mL（2 mol·L-1）的氢氧化钠溶液和 3.4 g的镍铝合金粉，室温下搅拌反应 8 h。反应完全后，过滤，用 50 mL 无水乙醇洗涤，滤液用盐酸调节 pH 值至 6，二氯甲烷萃取三次，收集有机相。水相用氢氧化钠溶液调至强碱性，再用二氯甲烷萃取三次，合并有机相。无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至 10 mL，趁热再加入 100 mL 的二氯甲烷，白色固体析出，析出的产物再用甲醇重结晶。得到妊娠烯醇酮胺（3）0.59 g。

　　2 结果与讨论

　　3β-羟基-孕甾-5-烯-20R-胺的合成路线如图 1所示。

　　3β-羟基-孕甾-5-烯-20-酮肟（2）：收率 95.0%；mp：221~223 ℃；1H NMR （DMSO-d6）δ（ppm）：3.10（m，H-3），5.26（s，H-6），0.56（s，H-18），0.94（s，H-19），1.73（s，H-21），10.33（s，N-OH）。

　　3β-羟基-孕甾-5-烯-20R-胺（3）：收率 30.8%；mp：207~209 ℃；1H NMR（DMSO-d6） δ：3.25（m，H-3），5.25（s，H-6），1.46（m，H-17），0.65（s，H-18），0.93（s，H-19），3.02（m，H-20），1.26（d，H-21）。

　　化合物的13C NMR 数据如表 1 所示。

　　2.1 反应过程讨论

　　合成妊娠烯醇酮胺的方法大体可分为两种：一是还原胺化法，二是将肟还原为胺。还原胺化法一般需要加压和氢气，常用在工业生产中，况且这种方法多用在较小的分子合成中，对于多环甾体化合物的合成较少使用[13]，而将肟直接还原为胺，只需要提供氨基的胺源，在平常的实验条件下就可完成。根据我们实验室的条件，选择了第二种方法。

　　2.2 化合物 3 结构解析

　　化合物 3 与 2 相比，双键未变，可直接 δ 120.2、δ 141.2 归属为 C6 和 C5，根据 HSQC 谱（如图 3 所示），δ 5.25 直接归属为 H-6 的化学位移。

　　在1H NMR 谱图中，位于 δ 0.65 和 δ 0.93 处的峰型都是单峰，并且质子数是 3，所以判断这两处都是甲基峰。HMBC 谱（图 2）显示，δ 141.2 与 δ 0.93处的氢有交叉关联，说明 δ 0.93 处的氢为 H-19，则可将δ 0.65 归属为 H-18。根据 HSQC 谱，δ 11.5 和 δ 19.1 可分别归属为 C18 和 C19。

　　根据 HMBC 谱图，H-18 应与 C12、C13、C14 和C17 有相关偶合，质子 H-18（δ 0.65）与 δ 38.3、δ 41.6、δ 53.8 和 δ 55.7 有交叉峰，而 DEPT 谱（图 5）显示，δ 38.3 为仲碳，δ 53.8 和 δ 55.7 为叔碳，δ 41.6 为季碳，因此 δ 38.3 和 δ 41.6 可分别归属为 C12、C13。

　　HSQC 谱显示，δ 38.3 与 δ 1.88、δ 1.14 处的氢有相关偶合，而 C12 中的两个氢所处的化学环境不同，因此化学位移不同，所以 H-12 的两个化学位移分别是 δ 1.88 和 δ 1.14。

　　在 HMBC 谱中，H-19 应与 C1、C5、C9 和 C10 有相关偶合，质子 H-19（δ 0.93）与 δ 36.8、δ 39.4、δ 49.3 和 δ 141.2 有交叉峰，DEPT 谱显示，δ 36.8为仲碳，δ 49.3 为叔碳，δ 39.4 和 δ 141.2 为季碳，而δ 141.2 为 C6 的化学位移，则 δ 39.4 可直接归属为 C10，而 δ 36.8 和 δ 49.3 可分别直接归属为 C1 和C9。根据 HSQC 谱显示，δ 49.3 与 δ 0.91 处的氢有偶合，δ 0.91 可直接归属为 H-9，δ 36.8 与 δ 1.75、δ 0.97处的氢有偶合关系，所以 δ 1.75 和 δ 0.97 是 H2-1 的化学位移。

　　根据1H-1HCOSY 谱图（图 4），δ 5.25 处的 H-6与 δ 1.91、δ 1.51 处的氢有相关偶合，则 H2-7 的化学位移为 δ 1.91 和 δ 1.51，在 HSQC 谱中，δ 31.1 处的碳与 δ 1.51 和 δ 1.91 有偶合，而 DEPT 谱中显示，δ 31.1 处的碳为仲碳，所以 C7 的化学位移为 δ 31.1。

　　H -6 与 H -8 有远程偶合，结合1H -1HCOSY 谱图，H-8 的化学位移为 δ 1.34，HSQC 谱显示，C8 的化学位移是 δ 31.2，在 DEPT 谱中，此处的碳为叔碳，进一步证实了 C8。与化合物 2 相比，H-21 的单峰消失了，说明 C20 位的肟基被还原，C20 位出现了氢，肟基变成了胺基。C14 与 C17 所处的化学环境不同，C17 受到吸电子基团胺基的影响，化学位移向高场移动，因此 C17 的化学位移是 δ 53.8，C14 的化学位移是 δ 55.7，结合 HSQC 谱图，H-17 的化学位移是δ 1.46，H-14 的化学位移是 δ 1.02。

　　HMBC 谱显示，δ 53.8 与 δ 1.26 处的氢有相关偶合，且此处的峰裂分为二重峰，说明 H-21 的化学位移是 δ 1.26，结合 HSQC 谱，C21 的化学位移是 δ 18.8，DEPT 谱显示，此处的碳为伯碳，进一步证实了 C21。

　　HMBC 谱显示，δ 53.8 与 δ 3.02、δ 0.65 处的氢都有相关偶合，且已知 δ 0.65 为 H-18 的化学位移，而 δ 3.02处氢的化学位移值较大，是受到了吸电子基团胺基的影响，因此 δ 3.02 为 H-20 的化学位移，结合HSQC 谱，可知 C20 的化学位移为 δ 50.1，而 DEPT谱进一步证实，此处的碳为叔碳。

　　由于 C3 位上的羟基未变，所以 C3 的化学位移化合物 2 相比没有太大的改变，结合 DEPT 谱和HSQC 谱，δ 69.9 为 C3 的化学位移，HSQC 谱显示，H-3 的化学位移是 δ 3.25。根据 HMBC 谱，δ 69.9 与δ 2.16、δ 2.08 处的氢有相关偶合，且此处的氢与 C5 也有相关偶合，说明 H2-4 的化学位移为 δ 2.16 和 δ 2.08，结合 HSQC 谱，可知 C4 的化学位移为 δ 42.1，DEPT谱显示此处的碳为仲碳，进一步证实了 C4。

　　H-3 与 H-2 应有偶合，而1H-1HCOSY 谱显示，δ 3.25 与 δ 1.65、δ 1.38 处的氢有相关偶合，则 H2-2的化学位移为 δ 1.65 和 δ 1.38，HSQC 谱显示，δ 31.3与 δ 1.65、δ 1.38 相偶合，则 C2 的化学位移为 δ 31.3，DEPT 谱显示，此处碳的类型为仲碳，进一步证实了C2。H-14 应与 H-15 直接偶合，而1H-1HCOSY 谱显示，δ 1.02 与 δ 1.61、δ 1.11 处的氢有相关偶合，则H2-15 的化学位移为 δ 1.61、δ 1.11，结合 HSQC 谱和DEPT 谱，可知 C15 的化学位移为 δ 23.6。DEPT 谱显示，δ 26.1 处的碳为仲碳，HSQC 谱显示，δ 26.1 处的碳与 δ 1.45、δ 1.80 处的氢有偶合，则推断 C16 的化学位移为 δ 26.1，而 δ 1.45 和 δ 1.80 为 H2-16 的化学位移。

　　HMBC 谱显示，δ 1.88 处的氢（H-12）与 δ 20.3 处的碳有偶合，1H-1HCOSY 谱显示，δ 1.88 处的氢（H-12）与 δ 1.49 处的氢有偶合，而 DEPT 谱显示 δ 20.3 处的碳是仲碳，即 C11 的化学位移是 δ 20.3，HSQC 谱显示，δ 1.49 和 δ 1.37 是 H2-11 的化学位移。根据 HMBC 谱，δ 4.65 处的氢与 δ 69.9、δ 42.1 和 δ 31.3 处的碳有偶合，即与 C3、C4 和 C2 有偶合，所以 δ 4.65 为 C3 位羟基上的氢。

　　1H NMR 谱图显示，δ 7.84 处的氢为单峰，HSQC谱显示，此处的氢没有与碳对应的相关峰，因此推测δ 7.84 是胺基氢的化学位移。20R 和 20S 的区别在于H-20 和 H-21 的化学位移，由于空间距离的差异，20R 型中的氮原子与 H-20 和 H-21 中的氢距离较近（与 20S 型相比），H-20 和 H-21 受到胺基的吸电子作用较大，化学位移值偏大，20R 中的 H-20 化学位移是 δ 3.02，H-21 的化学位移是 δ 1.26，而20S 中的 H-20 化学位移是 δ 2.64，H-21 的化学位移是 δ 0.90。

　　3 结论

　　利用酮肟还原法得到胺基甾体，采用重结晶的方法对产物进行纯化。通过1H NMR、13C NMR 和 2DNMR 技术对其结构进行解析，并详细归属了碳谱和氢谱数据，为其他的胺基甾体的合成、结构解析提供了参考。

　　参考文献：

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