运动性疲劳常用生化监测手段探究

　　摘    要：　运动员训练水平的提高就是一个“疲劳—恢复—再疲劳—再恢复”的变化过程。随着现代竞技水平的不断提高,运动负荷越来越大,适度的运动性疲劳施以合理的恢复手段可以促进人体机能水平的不断提高,而过度疲劳不仅对提高运动成绩不利,还会造成各种运动损伤,甚至损害运动员的身体健康。因此,准确判断运动性疲劳的出现和界定其疲劳程度,对制定科学的训练计划,提高训练效果,避免因过度疲劳引起运动损伤,具有重要的理论和实践意义。从唾液、血液、尿液、汗液、呼出气体等生物样品种类出发,对目前运动性疲劳的生化监测方法进行了总结及展望,探讨了呼出气体活体质谱分析方法在运动性疲劳监测和研究中的应用前景,该方法有望成为研究和监测运动性疲劳的一种有效手段。

　　关键词：　运动性疲劳; 生化监测; 呼出气体; 直接质谱分析;

　　Abstract：　The improvement of athletes′training level is a process of "fatigue-recovery-re-fatigue-re-recovery". With the constant improvement of the level of modern competition, the exercise load is getting bigger and bigger. Moderate exercise fatigue and reasonable recovery means can promote the constant improvement of human body function level. Excessive fatigue not only is unfavorable to improve sports performance, but also causes various sports injuries and even damages the athlete′s physical health. Therefore, it is of great theoretical and practical significance to accurately determine the occurrence of exercise fatigue and define its degree of fatigue. It helps to formulate scientific training plans, improve training effects, and avoid sports injuries caused by excessive fatigue. Based on the biological samples such as saliva, blood, urine, sweat and exhaled breath, this paper summarizes and prospects the current biochemical monitoring methods for exercise fatigue, and discusses the application prospects of exhaled gas in vivo mass spectrometry in the monitoring and research of exercise fatigue. This method is expected to be an effective means to study and monitor exercise fatigue.

　　Keyword：　exercise fatigue; biochemical monitoring; exhaled gas; direct mass spectrometry;

　　运动性疲劳是指:“机体的生理过程不能维持其机能在某一特定水平上或各器官不能维持预定的运动强度”[1]。运动员竞技水平的提高是训练导致适度的疲劳,并等其恢复后,人体机能状态在新的水平上获得适应的结果。因此,疲劳和恢复是运动员比赛训练中必不可少的部分。但如果训练负荷过量,机体得不到及时恢复,疲劳会逐渐积累,当超过机体耐受极限时,则对运动员健康造成很大伤害。因此,运动性疲劳的实时监测对科学安排训练计划,提高训练效果,取得优异成绩,同时避免因过度疲劳引起运动损伤,具有重要的理论和实践意义。

　　根据检测指标的不同,目前运动性疲劳的监测方法主要分为主观评价法、生理监测法和生化监测法。主观评价方法是运动员根据自己的训练情况,填写运动科学领域的问卷调查表进行测评,如《主观疲劳评定表》[2]、《视觉类比量表》[3]等。主观评价法虽具有方便、无创等特点,但是其评价结果受被测试者主观影响较大,评价结果不够客观、准确。因此,主观评价法更多的是作为辅助监测手段。生理监测是一种常用的运动性疲劳监测方法。研究发现,运动性疲劳发生后,会产生一系列的生理变化,如脑区细胞产生同向电流[4]、心率跳动偏高、体重下降、血压升高、肌肉张力下降等。因此通过对运动前后脑电图、心电图、体重、血压、肌肉张力等生理指标的变化进行监测,可评定运动员运动状态。常用的生理监测方法有生物反馈技术法[5]、循环测力计测试法[6]、心率变异性监测法(HRV)[6]等。采用生理监测方法虽然能够提供较为客观的检测数据,但检测结果受多种因素干扰,个体差异大,准确度有待进一步提高。
 

　　生化监测方法是近年来快速发展的一类运动性疲劳监测方法。因为机体运动与生物体的能量代谢和物质代谢息息相关,比如三磷酸腺苷代谢、磷酸腺苷代谢、糖代谢、蛋白质代谢、氨基酸代谢、乳酸代谢等,相应的代谢产物进入各循环系统并排出体外。与主观感受相比,这些代谢产物可直接反映运动员的生理状况。因此,可通过检测机体唾液、汗液、尿液、血液、呼出气体等生物样本中的相关代谢物,来监测机体器官的代谢状态,从而评价运动员的疲劳程度。生化分析监测法最大的优点为检测结果客观准确,并且随着分析技术的发展,在快速检测、无创检测、现场检测等方面均取得了较好的成果,表现出良好的应用前景。本文根据分析样本种类,对目前运动性疲劳的生化监测方法进行了总结评述,并对未来的发展趋势进行了展望分析。

　　1、 运动性疲劳监测的唾液分析方法

　　唾液中含有大量的生化分子,携带有丰富的生理信息,机体进行大强度运动时,唾液腺α-1和β-2肾上腺素能受体下降,导致唾液免疫球蛋白水平下降,因此唾液中免疫球蛋白水平可作为运动性疲劳监测的一种生物标志物[7]。目前,唾液免疫球蛋白的监测方法主要有免疫比浊法、放射免疫法、酶联免疫吸附法等三种方法。免疫比浊法具有快速、准确度高、选择性好、操作简单等优点,缺点是灵敏度不高。放射免疫法利用放射性同位素标记抗原或抗体,与被检测样品的抗原或抗体结合,形成抗原抗体复合物来进行分析。该方法具有灵敏度高、特异性好、精确定量、操作简便等优点,但是核素有放射性和半衰期,对人体有危害,试剂盒存货期短。因此,在体育科学研究中应用较少。酶联免疫吸附测定法是利用酶标记的抗原抗体特异性反应,然后通过酶与底物发生颜色反应,根据颜色变化进行定量,具有灵敏度高、特异性强、操作简便、重复性高等优点,被广泛应用于体育科学研究。如Moreira等采用酶联免疫吸附法研究了赛事的重要性对男子排球运动员唾液中皮质醇和免疫球蛋白的影响[8],研究结果表明,与常规比赛相比,冠军赛期间男子排球运动员唾液中的皮质醇浓度会升高,免疫球蛋白浓度会降低。

　　睾酮是一种类固醇荷尔蒙,它能促进蛋白质合成,增强肌肉力量,促进红细胞生长,提高血红蛋白含量,与人的运动能力密切相关,且与疲劳消除也有密切联系。因此,睾酮在体育科学研究中应用广泛,是运动员机能监测的一个重要指标。唾液中睾酮可采用气相色谱—质谱法分析法[9]、磁固相分离—酶联免疫测定法[10]等方法监测。比如,气相色谱—质谱法是通过对唾液样本的睾酮进行提纯、衍生化,最后进入质谱检测。该方法灵敏度高、特异性高,检出限可达20-50 pg/L[9],但分析步骤较多,耗时较长。磁性微粒分离酶联免疫测定法是酶联免疫系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定方法,该方法具有稳定性好、特异性强、对实验室设备要求不高,检出限为200 ng/L[10],在体育科研实践中有较好的应用。

　　2、 运动性疲劳监测的汗液分析方法

　　排汗是人体运动过程中代谢的一种表现,汗液中携带了丰富的机体代谢信息。测量汗液的pH值,可间接推测运动员的脱水程度,进而评价运动性疲劳程度[11]。传统汗液pH检测方法为显色法,通过化学试剂或者显色试纸来检测汗液pH值。这类方法所需汗液样本量大,检测速度慢,灵敏度和准确度均较低。基于显色反应机理,Curto等发展了一种pH敏感染料结合离子聚合物凝胶直接测试汗液pH值的方法(图1A),该方法可实时监测机体在不同状态下,汗液pH值(4.5-8.0)的变化,具有成本低,能耗低等特点[12]。但显色反应不可逆,且汗液进入芯片无法排出,芯片只能一次性使用。因此,Weber等用碳纳米管和石墨烯修饰的电化学传感器替代离子聚合物凝胶,增加了芯片的使用寿命[13]。

　　汗液中乳酸是另一种重要的运动性疲劳监测指标。人体剧烈运动消耗大量ATP和CP,当体内两种物质含量不足时,短时间机体会利用乳酸系统参与供能,产生大量乳酸[14]。目前,汗液中乳酸的检测已实现实时在线监测。比如Gowers S A等人发展了一种基于3D打印的微流控芯片监测汗液中乳酸的方法(图1B),该方法采用微透析探针刺穿皮肤进行微渗析采样,然后再通过电化学方法进行检测[15]。该方法能实时监测运动过程中乳酸的变化情况,但对皮肤有创伤。为了更好地贴合皮肤,实现实时无创监测,Imani等通过丝网印刷技术在高度柔软聚酯片材上制备了一种可穿戴的乳酸电化学无线传感器(图1C),以乳酸氧化酶(LOX)和改性的普鲁士蓝作为催化剂进行乳酸电化学检测[14]。

　　图1 汗液中pH和乳酸的典型分析方法

　　A.基于微流控的比色法;B.基于电化学分析的可穿戴乳酸 传感器;C.基于酶催化的可穿戴无线电化学乳酸传感器

　　3、 运动性疲劳监测的尿液分析方法

　　运动员进行高强度运动时,会消耗体内大量的营养物质,其排尿量及尿液成分会发生明显变化。因此,通过监测运动员运动前后尿液成分的变化,可判断运动员的疲劳程度,其主要监测的指标有尿蛋白、尿隐血、尿胆原、胆红素、尿肌酐、皮质醇、酮体等。比如机体产生运动性疲劳时,肾上腺素、去甲肾上腺素等分泌会增加,出现尿蛋白。尿蛋白的常用监测方法主要有考马斯亮蓝法[16]、双缩脲法[17]、苄乙氯铵比浊法[18]等。考马斯亮蓝法是利用考马斯亮蓝阴离子与蛋白质分子的NH+3基团反应后的颜色变化进行尿蛋白含量测定。该方法具有样本用量少,灵敏度高、操作简便、快速、显色稳定等优点,缺点是尿液基体复杂,在用于不同蛋白质测定时,偏差较大。双缩脲原理是蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+络合显蓝色,依据颜色的深度,计算尿蛋白的含量。该方法的不足之处是灵敏度低,检测需样量多。苄乙氯铵比浊法是利用苄乙氯铵在碱性条件下与蛋白形成沉淀物,对沉淀物体系进行比浊检测,该方法具有线性范围宽、灵敏度高、精确性高、重复性好,也可用于样品微量化监测,检出限为60 mg/L[18]。

　　常压质谱分析技术是无需样品预处理,可对样品进行快速分析的质谱技术[19]。电喷雾萃取电离技术[20]和内部萃取电喷雾电离质谱技术[21]是两种典型常压质谱技术,可实现液态、气态、黏稠态等多种复杂基体样品的直接质谱分析,具备灵敏度高、特异性好、分析速度快等优点,在尿液、血液分析中已有广泛应用[22],可检测其中的氨基酸、蛋白、脂质等多种生物分子。肌酐是肌肉中肌酸代谢产物,在体育科学研究中是反应机体肌肉疲劳的重要标志物,例如李雪等发展了一种结合同位素稀释技术和萃取电喷雾电离质谱技术分析尿液中尿肌酐的方法(图2),该方法具有灵敏度高(50 μg/L)、分析速度快(4分钟/样品)、准确度高等优点[23]。因此,这类直接质谱技术在运动性疲劳的监测中将具有重要的应用。

　　图2 萃取电喷雾电离质谱技术检测尿肌酐示意图

　　4 、运动性疲劳监测的血液分析方法

　　血液成分的监测可以提供丰富的机体机能变化信息,作为生物样本已被广泛用于运动人体科学研究。血液中常见的标志物主要有血红蛋白、血清睾酮、皮质醇、血乳酸、血尿素等生化标志物。例如,机体产生疲劳时,红细胞破坏,血红蛋白从红细胞中游离出,导致血液中血红蛋白下降。常见的血液中血红蛋白的检测方法有电化学检测法[24]、近红外光谱法[25]、质谱法[26]等。例如Xu等利用纳米银溶胶电极对血红蛋白良好的催化活性,发展了一种血红蛋白浓度检测方法[27],该方法具有灵敏度高、重现性好、选择性高等优点,线性范围2.0×10-7～1.0×10-5 mol/L,检出限为7.4×10-8 mol/L。近红外光谱法利用强散射介质对光吸收而进行血红蛋白定量检测[28],该方法的优点是无需采集血样、对人体无创伤、测量速度快、操作简便、可实时在线监测。缺点是精度不高、检测部位对检测结果影响较大。质谱技术由于具有高的检测灵敏度,是一种重要的血红蛋白分析技术。但传统质谱分析方法通常需要较多的样品预处理及较长的分析时间,难以满足快速分析要求。针对这些问题,宋丽丽等开发了一种内部萃取电喷雾电离质谱快速检测血红蛋白技术(图3)[27],首先利用功能化的氧化石墨烯选择性吸附血红蛋白,然后通过内部萃取电喷雾电离质谱技术对吸附了血红蛋白的石墨烯进行质谱分析。该方法具有特异性好、分析速度快(约4分钟/样品)、样品用量少(0.9 μL)等优点。

　　图3 内部萃取电喷雾电离质谱技术检测血红蛋白装置示意图

　　5、 运动性疲劳监测的呼出气体分析方法

　　呼出气体与心肺紧密相连,携带有大量的生物分子,通过检测人体呼出气体,可以获得机体丰富的生理/病理信息。在病理分析方面,如朱腾高等采用电喷雾萃取电离质谱技术(EESI)检测不同健康状态的志愿者接受中医推拿前后的呼出气体,结合化学计量学方法偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)区分了不同健康状态的志愿者,并揭示了志愿者接受中医推拿后,呼出气体中肾上腺素含量会显着变化,肾上腺素是机体产生运动性疲劳时与尿蛋白代谢相关的物质[29]。在生理分析方面,如陈焕文等首次采用其自主开发的电喷雾萃取电离飞行时间质谱(EESI-TOF-MS)对呼出气体进行了实时在线活体分析(图4A),检测到尿素、氨基酸、葡萄糖等与运动性疲劳相关物质,其中尿素是传统尿检方法监测运动性疲劳的常用标志物之一,从分子水平上证明了呼出气体与人体生理/病理状态之间存在密切联系(图4B)[20]。

　　图4 EESI-MS技术在呼出气体分析中的应用

　　A.用于呼吸气体分析的EESI- MS典型装置示意图;B.采用 EESI-MS检测呼出气体中的尿素和葡萄糖等生物分子

　　6、 总结及展望

　　随着国家对体育事业的重视以及全民运动健身的兴起,实现运动性疲劳的监测,对科学合理开展运动具有重要的意义。生化监测法通过对血样、尿样、唾液、汗液等生物样本中的运动性疲劳标志物进行检测,可有效判断运动性疲劳状态,是一种重要的运动性疲劳监测方法。目前,基于光谱分析、质谱分析、色谱技术、电化学分析技术,已开发了一系列运动性疲劳的生化监测方法,并已有较好的应用。但这些方法仍存在一些问题,比如在准确度、灵敏度、分析速度、采样方式等方面存在一定的不足,评价指标不够明确。未来运动性疲劳监测方法将在进一步明确评价指标的前提下,朝无创、高灵敏、高准确、快速、实时、现场等方面发展。

　　呼出气体与心肺紧密相连,携带有大量能反映人体生理/病理状态的信息,且相对血液、尿液等生物样本分析,呼出气体分析具有原位、实时在线、无创、快速、高通量、便捷等优点。虽然,目前呼出气体用于运动性疲劳的研究尚未有文献报道,但是已有文献表明采用EESI-MS质谱技术在呼出气体中检测到了与运动性疲劳相关标志物。以呼出气体为生物样本,采用直接质谱技术实时在线检测运动员运动前后呼出气体成分,研究运动员从开始运动到力竭状态整个过程中呼出气体的变化,结合化学计量学方法如聚类分析(CA),多块偏最小二乘分析(MB-PLS)、主成分分析(PCA)对质谱数据进行分析,寻找运动性疲劳标志物,建立运动员运动性疲劳损伤预警模型,为指导运动员科学训练,避免过度损伤,引发运动性疲劳提供重要的理论依据,这可能将是运动性疲劳监测与研究的一个新的发展方向。

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