“基因卫士”P53 是肿瘤抑制因子、细胞周期调控检查点、能量代谢和线粒体生物发生的调节者、氧化应激的平衡者, 位于多个细胞信号转导通路的核心位置, 对调节能量代谢、保持细胞氧化应激信号稳态、促进线粒体生物发生和保持生物体内稳态具有非常重要的作用. P53 被 DNA 损伤、缺氧、致癌因子等应激信号激活, 产生大量应答反应, 诱导细胞周期停滞、DNA 修复、凋亡或者细胞衰老等. 运动可在转录和翻译水平影响 P53 mRNA 的表达, 不同的运动方式能使 P53 在不同的细胞定位发生不同的运动性适应. 本文综述了 P53 信号稳态调节能量代谢、保持细胞氧化应激平衡的研究进展, 为相关科学研究提供参考.
1、 P53 研究概述
1992 年, Lane首次把 P53 称作“基因卫士”, 之前 P53 一直被认为是一种致癌基因. 肿瘤抑制因子P53 一直被生物学界认为是研究得最为透彻的一个基因, 然而最近 Matoba 等人、Bensaad 等人、Bartlett 等人把 P53 功能的研究逐渐拓展到了调节线粒体有氧呼吸、糖代谢、促进线粒体生物发生和氧化应激平衡等几个分子生物学研究较少的领域, 再一次引起大量相关领域研究者的密切关注.
P53 基因位于 17p13.1, 全长 20303 bp, 含 11 个外显子和 10 个内含子. 超过 4800 个基因含有至少 1个 P53 基序, 特异性结合到 DNA 反应元件后通过翻译后调控功能整合各种信号转导网络. P53 翻译后调控最常见的方式有磷酸化、泛素化、乙酰化、SUMO 化、糖基化、核糖基化、法尼基化、类泛素化和甲基化. P53 生理功能主要包括: 抑制肿瘤发生、诱导细胞凋亡、促进细胞生存、调节能量代谢、促进线粒体生物发生、平衡氧化应激、保持基因稳定、诱导自体吞噬、延缓细胞衰老.
P53 的细胞定位是影响其转录活性的决定因子之一. 正常生理状态下, P53 表达量较低, 半衰期为10~20 min, 而且穿梭于细胞质与核质, 但是 P53 完全能够协调多种基因表达以保护细胞免受基因毒性损伤和促进细胞生存. 当细胞处于应激状态时, P53就集中于核内, 经多种翻译后修饰, 活性提高、半衰期延长、累积量增加、与靶序列结合调控转录下游靶基因, 阻滞细胞周期或诱导细胞凋亡, 防止细胞异常增生. 最近研究发现, P53 和几个含有 P53 调控元件的基因产物也被定位在线粒体, 可能与调节线粒体 DNA(mtDNA)编码有关.
P53 属于一个多基因家族, 有 12 种 mRNA 和 9种蛋白, 不同的构型在不同的组织和细胞簇中表达不同的模式, 其中包括P63和P73. P53 的负调控者是鼠双微体-2(murine bouble minute 2, Mdm2)和E3泛素连接酶, 它们靶向 P53 到蛋白酶体降解. Mdm2和另一个同系物蛋白 MdmX 一起发挥作用也能下调P53 转录功能但不能降解 P53. 也有一些研究认为,保持 P53-Mdm2-MdmX 环路是非常重要的. 大约50%人类肿瘤表达了野生型的 P53, 但绝大部分过表达了 Mdm2. 肿瘤抑制因子 P53 一般作为序列特异性DNA结合转录因子, 然而, 最近也有文献描述P53与 RNA 通过序列非特异性相互作用, 但其生理功能角色尚不清楚.
2、 运动适应与 P53 在骨骼肌细胞中的表达
耐力训练促进线粒体生物发生, 有氧氧化能力增加. 腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase, AMPK)是“能量监测器”, 其信号转导通路激活监测肌肉能量变化并通过磷酸化 P53 丝氨酸 15 位点调节细胞能量代谢过程. 一些核基因编码的线粒体蛋白(丙酮酸脱氢酶, Bax, AIF 和 SCO2 等)具有 P53反应元件, P53 被磷酸化后启动一系列信号转导过程. Stambolsky 等人证明, 凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)是 P53 的一个转录靶基因. P53 能直接反式激活细胞色素 c 氧化酶合成 2 (synthesis ofcytochrome c oxicase 2, SCO2)的表达, SCO2 对整合线粒体细胞色素 c 氧化酶复合物的正常呼吸功能是很必要的, P53 缺失导致线粒体呼吸下降. P53 激活TP53, 诱导糖酵解和凋亡调节因子 (TP53-inducedglycolysis and apoptosis regulator, TIGAR)表达, 降低果糖-2,6-二磷酸酶水平并抑制糖酵解. 丁树哲等人发现, 骨骼肌 P53 对运动训练的反应既具有肌纤维类型特异性, 也具有运动强度敏感性.
抗阻训练后骨骼肌 P53 上调, 抗阻训练激活PI3K-Akt 信号转导通路, 诱导骨骼肌纤维体积和力量增加. 蛋白激酶 B(protein kinase B, Akt)通过磷酸化P53 结合蛋白 Mdm2 影响 P53 的活性, 磷酸化的 Mdm2转位到细胞核与P53结合增加P53蛋白的降解, P53水平降低导致 TIGAR 表达降低, 增加了己糖激酶(hexokinase, HK2) 和 磷 酸 甘 油 酸 变 位 酶 (phos-phoglycerate mutase, PGM)的活性, 从而促进糖酵解.
持续进行大强度耐力训练或者力量训练能造成长期的低葡萄糖水平, 随之阻碍或削弱身体机能. 哺乳动物细胞用葡萄糖作为产生 ATP 首要的燃料资源,糖缺乏时P53表现出对凋亡极大的抗性, 1次1 h急性耐力跑台训练后, P53 表达即增加, 启动一个适应性的反应, 不惜进行自体吞噬, 以增强细胞在更深的营养缺乏中生存的能力.
肿瘤抑制因子 P53 也与骨骼肌的重塑和衰老有关. P53 介导肌肉肥大的生化级联反应, 并且在激光照射、肌肉废用、肌肉失重和缺血引起的肌肉萎缩情况下 P53 都发生了变化, 在小鼠太空搭载后骨骼肌P53 蛋白聚集明显. 此外, 还有研究者观察了运动对平滑肌细胞 P53 表达的影响, 发现 P53 表达异常与动脉粥样硬化、经皮腔内冠状动脉球囊成形术后再狭窄、高血压等病理形成密切相关, 临床上把运动作为治疗动脉硬化、高血压的一种措施. 殷松楼和张宝慧研究发现, 大鼠胸主动脉损伤后运动组大鼠原癌基因 c-fos 和 c-myc 被控制, P53 表达增强. 结果提示, 运动对纠正原癌基因和抗癌基因表达失衡有作用(图 1).
3、 运动适应与 P53 调节糖酵解和线粒体有氧呼吸
糖酵解是细胞质中一种古老的无氧代谢过程,是一种爆发性的能源, 有氧呼吸能效高却是一个相对较慢的过程. 在需要能量快速释放时, 糖酵解产生ATP 方式更可能被优先利用, 比如骨骼肌纤维强烈收缩或者在快速增殖细胞中细胞结构(膜、细胞器)需要大量生物合成时. P53 通过转录靶蛋白 SCO2 和TIGAR 调控有氧呼吸和糖酵解, P53 灭活时细胞极大依赖糖酵解供能, 同时线粒体有氧呼吸受损.
3.1 运动适应与 P53 调节线粒体有氧呼吸
P53 是氧化磷酸化产生 ATP 的确定者. 细胞色素C 氧化酶(cytochrome c oxidase, COX)整合需要 SCO蛋白家族的参与, SCO 蛋白家族包括 SCO1 和 SCO2两种蛋白, 含有一个高度保守的 CXXXC 基序, 可能与转运铜离子到 COX 有关. 由于这个蛋白家族含有硫氧还蛋白, 具有一定的氧化还原功能. SCO1 转运铜离子到 CuA 位点, 与 COXCuA中心的成熟有关,SCO1 和 SCO2 在人所有组织中表达, SCO1 和 SCO2突变极大地降低了细胞内铜水平, 尤其在病人的心脏和肝组织中, SCO1 和 SCO2 在调节铜平衡时具有组织特异性. SCO2 是连接 P53 和有氧呼吸重要的一环, P53 在核内直接反式激活 SCO2, SCO2 移位到线粒体内膜合成电子传输链上 COX 复合物, SCO2 是第1个被确定的P53调控能量代谢的直接转录靶基因.
Saleem 和 Hood还发现, 急性运动直接诱导 P53 转位到线粒体, 增加骨骼肌 p53-Tfam-mtDNA 复合物,促进线粒体的生物发生.
3.2 运动适应与 P53 调节糖酵解
P53 在多个水平上影响糖代谢功能. 通过抑制葡萄糖转运子 1(glucose transporter 1, GLUT1)、葡萄糖转运子 4(glucose transporter 4, GLUT4)和己糖激酶Ⅱ(Hexokinase-Ⅱ, HKⅡ)转录阻碍糖摄取, 但是也有一些实例证明 P53 能通过增加 HKⅡ基因转录激活糖摄取, 在癌细胞中观察到 HKII 上调. GLUT4 蛋白与 HKⅡ共同合作维持着骨骼肌对葡萄糖的摄取能力,P53 调节 GLUT4 和 HKⅡ的表达, 从几个通路分别影响糖吸收和糖代谢进程. 运动时, 肌肉收缩激活以AMPK-GLUT4 为主的信号转导通路, 因此, 研发刺激 AMPK 的化学信息分子仿真运动时, GLUT4 移向细胞膜表面吸收葡萄糖的过程, 成为降血糖药物研发途径之一.
PGM 帮助磷酸甘油酸的可逆性重排, 是糖酵解通路中最后阶段的一个酶, 也被 P53 调节. PGM 的上调增加了糖酵解的流量, P53 能通过后转译调控机制抑制 PGM 的表达. 然而, PGM 基因含有一个 P53 反应元件, 在心肌病中也能介导 PGM 的转录激活.
这些功能上的二重性增加了 P53 调节糖酵解的复杂性. P53 也可能通过非依赖性通路调节 2 个主要的能量产生通路, 可能扩展到 1 个包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和AMPK 的代谢调控者的网络. 肌酸激酶(creatin-ekinase, CK)也是 P53 靶基因之一, 其编码的肌酸激酶脑型含有 P53 功能反应元件. CK 通过磷酸化ADP 和消耗磷酸肌酸恢复 ATP 水平, CP 是骨骼肌、脑和平滑肌能量仓库, 被 ATP 消耗激活. ATP 水平恢复也是 P53 保持细胞内环境稳态和促进细胞生存的功能之一.
TIGAR 是最近发现的调节糖酵解和保护细胞应对氧化应激的蛋白, P53可能调节 TIGAR激活糖异生,在果糖-6-磷酸阶段阻碍糖酵解并使糖酵解转向戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway, PPP). Green 和Chipuk报道 P53 的靶基因 TIGAR 改变了细胞利用糖的通路. 最近, 美国布朗大学研究人员已经成功绘制出 TIGAR 酶的三维结构图, 他们发现 TIGAR 本身也是在与癌症斗争中的“正面人物之一”, 其主要功能是帮助管理细胞中的能量生成. 细胞损伤能将其激活, TIGAR 被激活后能减缓细胞中的所有生命过程, 为修复损伤提供时间保障. TIGAR 被作为一种细胞损伤和修复的标记物, 为科学家提供了一个重要的线索, 指示癌症可能来临. 对 TIGAR 了解更多可以更早检测到癌症, 以进行预防性治疗.
4、 P53 协调营养通路和能量产生通路促进细胞生存。
肿瘤抑制因子 P53 协调多种通路保持线粒体能量水平促进细胞生存, P53 诱导的生存基因通过多种不同机制发挥作用. 例如, P53 上调的凋亡调控因子(P53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA)是一个促凋亡功能蛋白, 在P53依赖性凋亡通路中直接被P53 调节, 然而 PUMA 的抑制者锌指转录因子SLUG 本身也是 P53 靶基因产物, SLUG 抑制 PUMA表达进而阻抗 P53 诱导的细胞凋亡. 肌球蛋白Ⅵ(myosin Ⅵ)是一个非传统的 motor 蛋白, 被 P53 诱导,通过保持高尔基复合体整合来支持细胞生存.P21WAF1/CIP1在 P53 依赖性细胞周期停滞和生存功能中都扮演着中心角色. P53 激活 TIGAR 降低糖酵解,从而降低细胞内 ROS 水平. P53 还能诱导 Sestrins(SESNs)表达, 保护细胞免受过氧化氢(H2O2)损伤.
在糖缺乏情况下, P53 通过 AMPK 也发挥促生存功能. 此外, P53 也调节自体吞噬过程发挥促生存作用. 最近自体吞噬被认为是一种去除损伤细胞的肿瘤抑制机制, Levine 和 Kroemer认为自体吞噬被 mTOR 通路控制, 调节应答缺陷性细胞器、蛋白质聚集体、营养状况、温度、氧浓度和细胞密度. Feng等人和Stambolic等人认为, P53激活抑制mTOR并增加了自体吞噬, 这个过程通过 P53 转录上调mTOR 通路的抑制者之一磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, PTEN)发生. 当糖饥饿关闭 mTOR 通路时, 诱导 P53 磷酸化, P53 和mTOR 通路通过对话协助调节细胞增长、增殖和死亡.糖酵解、线粒体呼吸和自体吞噬被代谢控制, 可能存在一个P53参与的分子环路链接这3个过程以确保细胞生存.
然而最近发现, P53 一个反面角色: 野生型 P53在癌细胞中的促生存优势可能使其成为癌细胞基因组的卫士. 功能上的二重性是肿瘤抑制因子 P53的一个基本特征, 在组织发育和正常稳态期间促生存与诱导死亡之间的平衡都由时空模式来控制. 由于突变引起的P53所有功能灭活能导致P53二重功能全部失去, 当野生型的P53作为癌细胞中的一种背景而存在时, 将同样为肿瘤细胞的 DNA 修复提供一种生存优势, 来抵抗相应的癌症治疗进程.
5、 运动适应与 P53 调控细胞氧化应激稳态
细胞内氧化应激稳态的控制对细胞生存和发育非常重要, 氧化应激失衡能导致肿瘤和衰老发生.P53 不仅具有促氧化功能, 而且还具有重要的抗氧化作用, 功能上的二重性就是为了保持细胞氧化应激平衡. P53 本身含有半胱氨酸(cys), cys 含有氧化还原敏感性硫醇基(-SH), 所以具有氧化还原活性.cys124, cys135, cys141, cys182 和 cys277 被定位在P53 临近 DNA 结合域的环-折叠-螺旋区域, 构成了一个氧化还原调节的结构平台.
运动通过 AMPK 通路调节 SESN 和 P53 功能,P53 与 SESN, TOR, AMPK, 叉头转录因子和过氧化物氧化还原酶蛋白家族信号转导通路相互作用, 调节应激水平延缓衰老进程, 如肌肉衰减、骨质疏松、脂肪堆积、线粒体功能失调、心率失常、肌肉退行性病变等. 慢性疲劳综合征核因子 κB(nuclear factorκB, NF-κB)增加和 P53 缺失是关键机制. P53 灭活削弱了线粒体有氧呼吸并极大依赖无氧糖酵解供能,致使乳酸水平升高, 骨骼肌线粒体密度降低, 有氧耐力运动能力受损. NF-κB 与活性氧水平升高激活致炎细胞因子, 进一步激活糖酵解损伤线粒体功能, 不能满足 ATP 需求. 在慢性炎症和长期氧化应激环境下,高 NF-κB 和低 P53 水平还能以严重的脑功能受损为代价促进神经元和神经胶质细胞生存. 未来研究应进一步探究慢性疲劳综合征 P53 信号转导通路.
耐力运动减弱了 CD-1(ICR)衰老小鼠心肌细胞线粒体 P53 mRNA和蛋白表达、增加了 SCO2表达和 COX生物发生率, 降低了氧化应激, 起到抗衰老和保护心肌细胞的作用. 8 周耐力运动后 , Ⅱ型糖尿病Goto-Kakizaki 大鼠血清脂联素水平升高, 血清胰岛素和糖化血红蛋白水平降低, 骨骼肌谷胱甘肽含量和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比率增加, 骨骼肌 COX活性、mtDNA 标记物和 COXⅡ蛋白水平增加, 同时P53 蛋白水平和 TIGAR 表达降低, 表明耐力运动降低了胰岛素抵抗引起的氧化应激. 有研究认为, 衰老并不是由于分子损伤累积引起, 而是由于过度激活信号转导通路(包括 TOR 通路). 弱刺激(如卡路里限制、弱氧化应激、雷帕霉素、P53 诱导因子、运动和缺氧等)能抑制 TOR 通路, 激活修复, 最终降低损伤, 延长寿命. 氧化应激和线粒体功能失调可能是帕金森样神经退行性病变的诱因, 耐力运动能预防神经和线粒体功能障碍等引起的帕金森病. 长期运动减弱了细胞色素 C 的释放, 升高了 P53 水平, 二者皆与线粒体功能失调有关. 8 周耐力运动后大鼠肝脏醌氧化还原酶(NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1,NQO1)活性显著增加, NQO1 在调节 P53 等特殊蛋白的蛋白酶体降解时, 可能执行一种“持家基因”角色, 其拓展的细胞保护角色可能远远超过其高效的抗氧化物功能. 急性运动激活 C57BL/6 小鼠肝脏P53 和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase, MAPK)信号转导通路, 氧化应激可能不是主要角色, 低血糖等代谢应激可能是重要的确定因素.
锌是大量氧化应激保护蛋白和 DNA 修复的必需成分,缺锌增加氧化应激并削弱 DNA 修复功能, 引起 DNA损伤. 缺锌 Sprague Dawley 大鼠外周血细胞 P53DNA 结合能力降低, DNA 修复能力减弱. 9 周耐力运动后, 单独缺锌组、运动组 P53 和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)表达增加, 前列腺 DNA 并没有损伤, 但缺锌加运动组P53 和 PARP 表达没有增加, DNA 损伤加剧, 说明缺锌干预了 DNA 对应激的修复反应, 使前列腺对氧化应激敏感. 因此, 经常参加体育锻炼者应适当补充锌.
去神经野生型和 Bax 敲除小鼠细胞核、细胞质、线粒体P53含量均增加, 野生型小鼠氧化应激标记物过氧化氢增加, 但 Bax 敲除小鼠则没有发生这些变化. 说明干预凋亡靶基因可能对改善某些神经肌肉障碍导致的病理性肌肉萎缩是有效的.
6、 P53 可能影响糖脂代谢转换酶调节能量代谢底物利用
从 P53 对能量代谢的选择性调控来看, P53+/+可通过 SCO2 的转录调控促进线粒体有氧氧化, 同时通过 TIGAR 的转录调控抑制糖酵解, 将细胞能量代谢导向有氧氧化方向, P53-/-, P53 沉默或突变则相反.
糖酵解与有氧氧化是不同的 ATP 合成方式, 这种不同不仅在于 ADP 的磷酸化方式不同, 更在于底物选择上的不同. 糖和脂肪是线粒体有氧氧化合成 ATP的主要底物, 但糖的有氧氧化需经历糖酵解途径,P53+/+抑制糖酵解, 促进有氧氧化, 意味着这种有氧氧化的底物很大程度上只能是脂肪. 换言之, P53+/+有着节省糖原、消耗脂肪的良好效用. 长期有氧训练使机体能量代谢出现糖原节省化现象, 已是众所周知, 但其机制并不清楚. Bartlett 等人[70]对此进行了研究, 通过肌肉活检发现一次急性高强度间歇性运动,运动后即刻至运动后 3 h, 与高糖组相比, 低糖组P53Ser15磷酸化水平和丙酮酸脱氢酶激酶 4(pyruvatedehydrogenase kinase 4, PDK4) mRNA 表达显著升高,肉碱棕榈酰基转移酶-1(carnitine palmitoyl trans-ferase-1, CPT-1)水平也有增高趋势. 说明运动训练环境下, 随着可利用糖含量降低, P53 信号转导通路激活, 骨骼肌氧化能力增加, 底物选择朝向“节省糖原、消耗脂肪”的方向. 这种“糖原节省化”现象对于运动员训练和临床均有十分重要的意义.
7、运动与 P53 调节信号转导通路的关系及前景展望
适宜的运动能保持P53信号的稳态表达, 在肿瘤和衰老之间保持平衡状态. 目前基础性研究已深化至亚细胞和分子水平, 为揭示运动器官适应性的形态结构与功能代谢基础、发生机制、运动性伤病的组织病理作出了重要贡献. 分子生物学技术逆转录聚合酶链式反应技术的应用, 使运动性骨骼肌疲劳与恢复机制的研究也取得了显著的进展, 认为慢性疲劳综合征、运动性微损伤、运动性疲劳及过度疲劳的发生可能与细胞损伤和细胞凋亡有关, 这些症状的发生与 P53 信号转导通路的关系将是今后关注的重点, 具有广泛的研究前景.
“追求最佳运动表现”是每一个教练员和运动员追求的共同目标, “糖原节省化”是他们最为关切的问题. 底物可利用性和底物的选择性利用是决定运动成绩的关键, 因此, 今后的研究应该更加关注糖原储备、糖和脂肪底物选择与 P53 信号转导通路的关系,为指导科学训练奠定分子基础. 此外, 有氧能力取决于线粒体含量及功能, 耐力运动激活P53信号转导通路促进线粒体生物发生, 对于耐力运动员来说是提升其运动表现的关键, 这个通路也应该成为未来研究的重点.
对于普通健身人群来说, 运动能力下降是衰老的机能表现之一, 能量代谢是运动能力的基本保障,同时运动也是改善能量代谢的最有效手段, 相信 P53很可能是其中重要的分子衔接, 进一步探讨运动对P53 的作用及其能量代谢调节机制显然更靠近人们对延缓衰老的现实需求. 本实验室研究显示, 不同运动训练强度对骨骼肌P53基因表达影响不同, 在不同生理条件下, P53 对运动训练的应激性和适应性反应不同. 本研究成果将对进一步揭示体育锻炼延缓衰老、维持体能的生理生化机制发挥指导作用.
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