基因工程论文
摘要：桂花是重要的园林经济树种, 加强其快速繁殖和新品种培育对推进桂花产业发展具有重大意义.文章依据近30年的桂花组织培养研究成果, 分析了影响桂花胚、茎尖、茎段、叶片及花梗等不同外植体培养的因素, 并综述了桂花在花色、花香等方面的基因工程研究进展, 以期为桂花的分子育种工作提供参考.
关键词：胚培养; 茎尖培养; 茎段培养; 桂花;
Advances in Tissue Culture and Genetic Engineering on Osmanthus fragrans
CHEN Si HUANG Zhou YANG Mengting PANG Jiliang GAN Jianping XU Junchi
School of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains, Huanggang Normal University
Abstract：
Osmanthus fragrans is an important economic garden tree in China.It is of great significance that the research of its rapid propagation and breeding are carried out to promote the development of O.fragrans industry.According to the test data of tissue culture in O.fragrans for recent thirty years, the successful cultivation factors of different explants, such as embryo, stem apex, stem segments, leaf and stalk are analyzed.The overview of recent advances on O.fragrans genetic engineering in flower color and fragrance is provided, which is aimed to provide reference for the molecular breeding of O.fragrans.
Keyword：
embryo culture; stem apex culture; stem segment culture; Osmanthus fragrans;
桂花 (Osmanthus fragrans Lour.) 又名九里香、木犀等, 是我国传统十大名花之一, 系木犀科常绿灌木或小乔木, 分为金桂、银桂、丹桂、四季桂和彩叶桂5个品种群[1].桂花在我国已有2500多年的栽培历史, 为亚热带短日照植物, 广泛栽培于长江流域及其以南地区, 并且形成了四川、浙江、广西、湖南、湖北、安徽等重点产区[2].桂花是香花植物中最具观赏和实用价值的植物, 不仅在园林和庭院的绿化、美化及香化上具有特殊地位, 而且可以用来提取香精, 制作桂花酒、桂花糕等, 果实可以榨油, 桂木亦可制作家具, 可以说浑身是宝[3].自进入21世纪以来, 我国桂花研究在资源、品种、栽培、繁殖、育种、发育、花香、切花、文化等各个领域全面展开, 且取得了明显成果, 再加上2004年我国获得木犀属栽培植物国际登录权威, 更是极大推进了我国桂花产业的蓬勃发展[4].本文综述了桂花组织培养和基因工程的研究现状及其存在的问题, 以期为后续的桂花分子育种等研究工作提供参考.
1 桂花组织培养研究进展
木本植物的组织培养再生途径可以分为两类[5]:一是器官发生, 包括外植体直接分化成器官的直接发生和外植体先脱分化形成愈伤组织再分化成器官的间接发生;二是胚状体发生, 指外植体按照胚胎发生方式形成再生植株.迄今关于桂花的组织培养已经积累了不少经验, 本文就桂花胚、茎尖和茎段、叶片和花梗的培养进行综述.为方便查阅, 本课题组将已收集到的资料编成名录 (表1) , 总结了桂花组培外植体的取材部位、品种、初代培养基、继代培养基、生根培养基及再生方式等.
表1 桂花组织培养名录Tab.1 Directory of tissue culture on O.fragrans
注:1.O1为器官直接发生途径, O2为器官间接发生途径, E为胚状体途径.2.培养基B5+6-BA 1.0+GA 3.0表示B5+6-BA 1.0mg/L+GA 3.0mg/L, 以此类推.
表1 桂花组织培养名录Tab.1 Directory of tissue culture on O.fragrans
注:1.O1为器官直接发生途径, O2为器官间接发生途径, E为胚状体途径.2.培养基B5+6-BA 1.0+GA 3.0表示B5+6-BA 1.0mg/L+GA 3.0mg/L, 以此类推.
1.1 桂花胚培养
胚的发育时期和取材时间是影响其组培成功的关键因素之一.桂花胚发育时期为:当年12月上旬, 原胚发育至球形胚;12月下旬至次年1月上旬, 发育至心形胚;1月下旬至2月上旬, 发育至鱼雷状胚;2月下旬至3月上、中旬, 幼胚的发育基本完成, 形成成熟胚[33].袁王俊[34]对5个时期的桂花胚 (球形胚、鱼雷胚、胚乳尚未硬化、胚乳硬化、果皮发紫) 进行离体培养, 发现桂花胚合适的取材时间是胚乳完全硬化到果实完全成熟之间, 即3月中上旬, 此时胚生理上虽未成熟, 但形态上已经成熟, 呈乳白色, 长5mm左右, 子叶明显.
胚在接种前经过适当的预处理, 如低温、干燥、光照等, 可以增加萌发率和出愈率[35].梁茂厂[12]发现种子4℃冷藏处理210d能有效打破种胚的自然休眠, 促进种子提前萌发.鉴于桂花种子有一层坚硬的内果皮包被, 种胚极少受外界细菌的污染, 所以多数研究对去掉外果皮的种子采用的灭菌方式为:75%酒精浸泡30~60s后, 0.1%升汞溶液消毒3~6min.这样既能降低污染率、褐化率, 又能保证外植体的活力.
诱导桂花胚离体培养形成组培苗常采用器官直接再生和间接再生两种方式, 如表1所示.袁王俊[34]比较MS、B5和DCR 3种培养基的培养效果时, 发现胚在B5中的生长状况更好.韩瑞超[31]则发现桂花幼胚在MS和B5这两种培养基上的萌发率不存在显著性差异, 但胚在MS中的长势优于B5.刘友全等[8]也发现相较于B5和LMc, MS更有利于促进幼胚苗正常生长.就培养基而言, MS和B5中都含有较高浓度的无机盐, 只是B5中铵盐的浓度较低, 但两者都能够满足幼胚萌发初期对矿质营养的需求.
至于培养基中的激素配比研究, 即细胞分裂素/生长素的相对浓度设置, 均围绕Skoog和Miller的“激素平衡学说”展开.桂花组织培养中, 常用的细胞分裂素有6-BA (6-benzylaminopurine, 6-苄氨基嘌呤) 、KT (kinetin, 激动素) 、ZT (zeatin, 玉米素) 和TDZ (thidiazuron, N-苯基-N’-1, 2, 3-噻二唑-5-脲) , 生长素有NAA (α-naphthaleneacetic acid, 萘乙酸) 、2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4-二氯苯氧乙酸) 和IBA (indole-3-butyric acid, 吲哚丁酸) .在桂花胚直接分化的初代培养中, 细胞分裂素是主要因素, 因为胚内可能存在某种抑制物, 例如ABA, 它会导致种子休眠, 而6-BA可以促进ABA的降解, 解除种子的休眠, 促使胚提前萌发[11,36], 或者配合使用一定浓度的GA也能达到目的[10];生长素的作用是次要的, 邓黎[9]所做的6-BA和NAA交叉因子试验显示, 在基本培养基中只施加1.5mg/L 6-BA最有利于胚的启动.其他研究者也认为, 1.0~2.0mg/L的6-BA有利于胚的萌发[8].而在诱导桂花胚脱分化形成愈伤组织时, 生长素是必不可少的, 不过应控制在0.1~0.5mg/L.李球红等[14]发现胚在1/2MS+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA培养基上, 愈伤化率可达100%, 而且形成的愈伤在此培养基中继续培养多代后能分化出丛生芽.不同品种的桂花在相同的培养基上, 其生长状况和芽分化也是不同的, 说明外植体基因型的差异也会影响培养效果.至于胚幼苗的伸长生长, 多使用MS (B5) +2.0mg/L GA[8,9].在生根方面, 研究者的结果比较一致, 培养基为1/2MS (B5) +2~3mg/L NAA+0~0.05mg/L 6-BA[6,7,8,9,10,11,12].另外, 切掉部分胚根有利于侧根发育, 根数增多[10].
通过胚状体途径诱导桂花胚产生胚性愈伤组织, 然后生成植株的研究则比较少, 目前国内外仅见3篇报道[15,16,17].综合三者的研究发现, 金桂合子胚的子叶端是诱导体细胞胚的良好外植体, MS培养基比WPM、B5更有助于胚性愈伤组织形成, 初代培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L 2, 4-D或者MS+0.5mg/L KT+1.5mg/L 2, 4-D时都能使胚性愈伤组织诱导率高达83%以上, 在继代培养中则以不添加任何植物激素的MS培养基更有利于体细胞胚的形成和发育.
1.2 桂花茎尖和茎段的组织培养
袁王俊等[20]比较了休眠芽、萌发芽和当年生幼枝三者的茎尖组培差异, 结果发现:正在萌发芽和尚未停止生长的幼枝顶芽是较好的茎尖取材材料.休眠芽由于长时间暴露在空气中, 易感染病菌, 所需消毒时间较长, 且存活率较低, 不宜作为茎尖组培材料.茎尖采用的消毒方式和胚类似, 萌发芽以升汞处理5min为好, 存活率可达94.1%[20];嫩枝以不经过乙醇处理、升汞直接消毒2.5min最佳, 存活率可达95.6%[18].
在桂花茎尖的初代培养中, 袁王俊[34]发现合适的基本培养基是B5, 而以MS为培养基时, 无论是冬季休眠芽还是萌发芽都不能萌发, 且DCR的培养效果也不佳.该研究还确定了休眠芽、萌发芽和幼枝顶芽离体启动培养所需的6-BA浓度, 随着芽在植株上的萌发和抽枝, 所需要的6-BA浓度逐渐降低, 此外三者的萌发能力表现为萌发芽>幼枝顶芽>休眠芽.组织培养中基因型的差异会影响再生能力是一种常见现象, 表现为种间、品种间的再生能力有较大差异, 因此在选择激素配比时也要考虑这一因素.蔡新玲[29]以金桂、银桂、丹桂、四季桂4种桂花品种群的茎尖为试材, 分析比较了基本培养基 (B5、LMc) 和不同浓度6-BA及NAA对茎尖丛生芽诱导的影响, 结果发现, 金桂的最佳培养基为B5+2.0mg/L 6-BA+0.12mg/L NAA, 银桂为B5+7.0mg/L 6-BA+0.12mg/L NAA, 丹桂为B5+7.0mg/L 6-BA, 四季桂仅分化出少量丛生芽;品种群之间的萌芽率优势差异表现为金桂≥银桂>丹桂>四季桂.
茎段培养的取材部位主要是带腋芽的新梢茎段, 宋会访[7]探究了不同取材时间 (2月下旬、3月上旬和3月下旬) 对桂花新梢初代培养的影响, 发现最佳的取材时间为2月下旬, 而3月下旬不适合桂花茎段培养取材, 取材的污染率、褐变率都比较高.这一结果也反映了桂花在其生长开始的季节取材较好, 在生长期或已进入休眠期取材则因外植体在培养中污染率高、褐化率高和反应迟钝而不能培养成功.桂花茎段在空气中由于暴露时间较长且具有皮孔易含内生菌, 所需的升汞消毒时间较长, 一般10min左右[21,22,23,24,25,26].
梁茂厂[12]比较了MS、B5和WPM对茎段萌发的影响, 结果发现B5培养效果最好.而吕志鹏[25]的研究结果则表明MS相较于B5和改良的MS而言更有利于茎段不定芽诱导和愈伤诱导.不过归纳来看, 茎段初代培养多选择MS.宋会访等[24]以金桂为试材, 探究发现KT诱芽效果比TDZ好, 新梢茎段在LMc+8.0mg/L KT+0.1mg/L NAA的培养基上萌芽快且腋芽长而粗壮, 而TDZ诱导的茎段切口处产生大量的愈伤, 抑制了芽的萌发, 因此TDZ更适合茎段愈伤组织诱导.
1.3 桂花叶片和花梗的组织培养
桂花叶片和花梗的组织培养不同于胚、茎尖和茎段, 只能通过愈伤诱导再分化芽.胡甜甜等[28]以桂花幼嫩花梗和叶片为外植体, 发现花梗最佳消毒方式为5%NaClO消毒3min, 叶片最佳消毒方式为0.1%HgCl2消毒5min.在叶片取材方面, 以新生幼嫩的叶片为宜.另外, 李林[30]]发现在同一激素配比的培养基中, 同一叶片不同位置的出愈情况是相同的, 并没有因为位置不同而产生不同的分化.叶片的腹面朝上和背面朝上这两种接种方式对愈伤组织诱导也没有显著影响[31]].
蔡新玲[29]以丹桂叶片为试材探究发现, 叶片在B5培养基上出愈率最高, 而在MS和LMc两种培养基上未诱导出愈伤.梁茂厂[12]也比较了MS、B5和WPM对金桂叶片愈伤的诱导, 结果表明B5和WPM是较合适培养基.在激素配置上, 具体用量要考虑到组织内源激素和外源激素效应的总和.蔡新玲[29]发现适合金桂叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为B5+1.0mg/L 6-BA+0.6mg/L 2, 4-D, 出愈率可达92%;梁茂厂[12]却认为金桂叶片最适诱导配方为B5+1.5mg/L 6-BA+0.12mg/L 2, 4-D, 出愈率可达100%.二者6-BA和2, 4-D相对用量的差异, 是源于研究时所选取的品系材料、激素浓度梯度以及试验方法等多因素的差异, 说明任何一种材料组织培养的最适配方并不是绝对的, 具体试验应用时需考虑相对条件.彭尽晖等[32]以四季桂幼嫩花梗为试材, 培养在MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L 2, 4-D上, 出愈率可达85.17%.该研究还发现, 继代培养中采用2, 4-D, 愈伤增殖率虽高, 但易使细胞老化, 丧失活力.韩瑞超[31]也证明了2, 4-D不利于桂花幼叶愈伤的生长与增殖.
目前还没有关于桂花叶片、花梗及茎段愈伤再分化出芽的报道, 对愈伤的研究停留在继代增殖阶段.不过, 王珍华等[27]以大花金桂的子叶为外植体, 在1/2MS+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA培养基上培养多代后成功实现了桂花愈伤组织分化成苗.这反映了不同桂花组织诱导的愈伤存在某些特性, 需要扩大实验因素范围, 使用更多外源激素和其他添加物, 探索芽点形成的条件.
2 桂花基因工程研究进展
基因工程操作包括上游的基因克隆和下游的遗传转化, 通过将某些功能基因导入植物体内使其性状稳定表达是现代植物育种中的一种重要手段.目前桂花基因工程研究多集中在基因克隆方面, 而鲜有桂花遗传转化的报道.
2.1 桂花基因的克隆
NCBI (National Center for Biotechnology Information, 美国国家生物技术信息中心) 收录的桂花基因序列主要与花色和花香相关.桂花花色主要由类黄酮和类胡萝卜素两类物质决定, 目前这两者的生物合成途径解析得较为透彻, 涉及多个代谢步骤、多种酶催化, 以及与之相关的基因调控.桂花类黄酮生物合成代谢途径中OfPAL、Of4CL、OfC4H、OfCHS、OfCHI、OfDFR、OfANS和OfMYB1等关键结构基因[37,38,39,40,41,42,43], 以及类胡萝卜素生物合成代谢途径中OfCCD1、OfCCD4、OfPSY、OfPDS、OfZDS和OfZ-ISO等关键结构基因[44,45,46,47]相继被克隆和研究.通过分析桂花花色素结构基因的作用特性, 就可以借助反义RNA技术、外源基因插入、核酶抑制及共抑制作用等方法[48]顺势改造桂花花色, 培育出更多更有观赏价值的新品种.
植物花香物质主要分为3大类:萜类、苯基/苯丙烷类、脂肪酸衍生物.萜类化合物是植物花香物质中最大的类群, 也是许多植物香味物质的主要成分[49].在桂花中, 一些与萜类化合物合成相关的基因已被成功克隆, 如OfTPS、OfDXS、OfGES、OfADH、OfDXPS、OfAACT和OfLIS等[50,51,52,53,54,55].这些关键基因的分离, 为桂花香气品质遗传改良提供了可能.从分子水平对植物花香进行改良主要有两种方法:一是引入花香相关的外源基因;二是调控内源相关基因的表达.但是此过程需要注意:一是从转化植株中产生的芳香挥发物可能被修饰成非挥发性的物质;二是在转化植株中缺少合适的底物产生相应芳香挥发物;三是即便在转化植株中产生挥发性物质, 也可能不足以被人类的嗅觉所感知[56].
2.2 桂花遗传转化的研究
木本植物转基因操作中应用比较成熟的技术主要是农杆菌介导法, 该技术已经在杨树、番木瓜、苹果等多种木本植物中得到成功的应用[57].此外也有用基因枪法、电击法和PEG (polyethylene glycol) 法进行转化.虽然有研究者对桂花转基因进行了试验, 但目前未见转化成功的报道.本课题组在建立桂花遗传转化体系方面做过不少尝试.李球红[58]构建了FYF (FOREVER YOUNG FLOWER) 的过表达载体, 拟将其转入桂花中以得到花期延长的新品种.试验采用绿梗籽银桂、“庐州黄”籽银桂和莲籽丹桂的幼胚, 以及大花金桂子叶切块和天香台阁花芽的愈伤作为转化受体材料, 利用超声波辅助的农杆菌介导法进行转化, 虽然得到了抗性愈伤, 但愈伤褐化率较高且基本不分化.因此, 利用转基因技术对桂花进行品种改良任重道远, 外植体的取材、培养基的激素配比、转化方法的选取以及褐化的控制等条件仍需进一步探索.
3 展望
桂花在园林绿化上虽应用广泛, 具有诸多优点, 但也存在些许不足.例如, 桂花单朵花期极短, 仅7d左右, 使其美化、香化功能受到了限制;其次香气馥郁的桂花品种主要是金桂和银桂这两类秋桂品种群, 四季桂除了天香台阁等品种外鲜有香气浓郁的, 也限制了其香化的功用;桂花的抗寒能力弱, 长江以北难以栽培.因此, 如何培育出花期长、抗寒能力强的桂花新品种, 是今后桂花育种中的长期课题.建立成熟的遗传转化体系的第一步是建立高效的离体快繁体系.桂花组织培养研究虽取得了不少进展, 但仍存在外植体增殖率低、胚性愈伤诱导分化体系不成熟等问题, 因此仍需加强桂花组织培养研究, 为桂花分子育种研究奠定基础.
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