染色质的基本结构是核小体，由约１４７ｂｐ ＤＮＡ缠绕在Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３，Ｈ４各两分子形成的组蛋白八聚体构成．研究染色质的结构对于揭示真核生物基因表达调控的机理有着重要意义．但是在体内真核生物的染色质的形成会受到各种因素的干扰，在体外将ＤＮＡ和组蛋白组装成核小体结构可以排除这些因素的影响来模拟核小体的形成，而且体外将一段短的ＤＮＡ片断重构到组蛋白八聚体上，其核小体定位主要取决于缠绕的ＤＮＡ序列特性．此外，通过染色质体外组装系统，可以将不同修饰状态的组蛋白和特定ＤＮＡ模板组装成染色质结构，进而进行体外转录实验，研究组蛋白的不同修饰状态以及组蛋白变体等对基因转录的表观遗传调控作用．因此，为了更好得研究基因表达调控的机理，进行染色质的体外组装是有必要的．目前，染色质体外组装主要有两种方式：一种是采用盐透析的方法，另一种是依赖ＡＴＰ及蛋白因子（ｄＮＡＰ Ｉ和ＡＣＦ）进行的染色体体外组装．本实验构建了含目的片段６０１及ＥＳ１，ＣＳ１序列的质粒，运用ＰＣＲ的方法获得了目的片段，利用盐透析法进行了体外组装核小体结构并用Ｂｉｏｔｉｎ标记法和ＥＢ染色法进行了检测．
１材料与方法
１．１材料
１．１．１试验菌株
大肠杆菌ＤＨ５α由本实验室保存，重组质粒ｐＵＣＣＳ１，ｐＵＣＥＳ１，ｐＵＣ６０１由本实验室构建．
１．１．２试剂和仪器
质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自上海生工，Ｔａｑ酶、限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司，Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ａｌｋａｌｉｎｅ－ＡＰ，ＣＤＰ－Ｓｔａｒ－ＣＤＰ购自罗氏公司．
１．２方法
１．２．１质粒的构建
（１）含目的片段质粒的构建ＤＮＡ片段ＣＳ１和ＥＳ１分别为：
ＣＳ１：ＣＧＧＧＡＡＴＴＴＣＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＧＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡ
ＥＳ１：ＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣ ＧＧＧＣＡＣ－ＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣ
ＤＮＡ片段化学合成后，连接到ｐＵＣ１９质粒的Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和ＥｃｏＲ Ｉ两酶切位点（上海生工合成克隆）．
（２）含６０１序列重组质粒的构建用ＢａｍＨ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ双酶切含有６０１序列的ｐｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ重组质粒，分离６０１序列，酶切体系为：质粒ＤＮＡ １０μＬ，Ｂｕｆｆｅｒ Ｋ ５μＬ，ＢＳＡ ０．５μＬ，Ｂａｍ ＨＩ（２０Ｕ／μＬ）２μＬ，Ｐｓｔ Ｉ（１０Ｕ／μＬ）３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ２９．５μＬ，总体系５０μＬ，３７℃酶切３ｈ；然后将切下的６０１ＤＮＡ序列连接到ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ两位点之间，酶连体系为：
６０１ＤＮＡ序列４μＬ，双酶切回收后ｐＵＣ１９载体２．５μＬ，Ｔ４ｌｉｇａｓｅ １．５μＬ，Ｔ４ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ５．５μＬ，总体系１５μＬ，１６ ℃酶连２０ｈ；取４μｌ酶连产物转入１００μＬ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ中．挑取单克隆提取质粒进行酶切、测序鉴定．
１．２．２目的片段的获得
分别设计６０１序列、ＥＳ１，ＣＳ１ＤＮＡ片段的ＰＣＲ扩增引物，由上海生工合成Ｂｉｏｔｉｎ标记与未标记的引物，引物的序列见表１．６０１ＤＮＡ序列ＰＣＲ扩增程序为：
９５ ℃ ５ ｍｉｎ；９５ ℃ ２０ｓ，５３ ℃ ２０ｓ，７２ ℃ ３０ｓ，３２个循环；７２ ℃１０ｍｉｎ；４℃保存．ＥＳ１，ＣＳ１ＤＮＡ片段ＰＣＲ扩增程序为：
９５ ℃ ５ｍｉｎ；９５ ℃ ２０ｓ；６２ ℃ ２０ｓ，７２ ℃ ３０ｓ，３２个循环；７２℃１０ｍｉｎ；４℃保存．用ＰＣＲ大量扩增获得目的片段，取５μＬ ＰＣＲ产物加入１．５％琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余用胶回收试剂盒回收目的片段，４０μＬ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ回溶．
１．２．３组蛋白八聚体表达、纯化与复性按参考文献［８］中的方法分别表达四种组蛋白，纯化后进行复性，同时装配形成组蛋白八聚体．１．２．４体外组装核小体。将纯化的组蛋白八聚体与目的ＤＮＡ片段以一定的比例加入到含有２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的ＴＥ缓冲液中混匀，总体系８０μＬ，然后加入透析管（Ｔｈｅｒｍｏ，１０ ０００ＭＷＣＯ）中，放入含２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的ＴＥ透析液中透析１６ｈ，在此过程中用恒流泵（ＨＬ－ＺＳ，上海青浦西仪器厂）将ＴＥ缓冲液匀速滴入透析液中，使其中ＮａＣｌ的浓度降到０．６ｍｏｌ／Ｌ；将透析管转入到不含有ＮａＣｌ的ＴＥ缓冲液中透析３～６ｈ．１．２．５ Ｂｉｏｔｉｎ标记检测。
取组装后含有１００ｎｇ ＤＮＡ的样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，１１０Ｖ，３ｈ；然后在２５ｍＡ条件下转膜３６ｍｉｎ；将转好的膜放到紫外交联仪中交联，至焦耳数降到２焦耳；加封闭液（５％ ＳＤＳ，１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１７ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４，８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４）将膜封闭１ｈ；加入抗体放在水平摇床摇４５ｍｉｎ；加入清洗液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２）洗５次，每次１０ｍｉｎ；加底物２００μＬ；将Ｘ光片曝光、洗片．１．２．６琼脂糖凝胶电泳。组装后样品在１．５％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳后ＥＢ染色，凝胶成像仪拍照观察分析．
２结果与分析
２．１重组质粒的构建
将理论设计的ＥＳ１，ＣＳ１序列及６０１序列片段插入ｐＵＣ１９质粒的多克隆位点后，由于质粒含有抗氨苄青霉素的基因，所以通过在含氨苄青霉素的固体平板上进行初筛，提取质粒后利用ＰＣＲ和酶切 的方法进行二次鉴定后，最后通过测序确定了构建重组质粒的正确性．
２．２目的片段的获得
ＰＣＲ扩增ＣＳ１以及标记有ｂｉｏｔｉｎ的ＣＳ１－Ｂ目的片段，琼脂糖凝胶进行电泳检测的结果如图１所示．目的片段为１５７ｂｐ，从图中可以看出目的条带介于１００ｂｐ～２００ｂｐ之间．将所有ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收后用于组装核小体实验．２．３组蛋白八聚体的体外构建。
分别将４种组蛋白表达纯化后，用考马斯亮蓝法测定浓度，以等摩尔比例混合复性，用分子筛纯化，纯化后目的样品用１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，结果如图２所示．从图中可以看出，样品Ｃ２－Ｃ５浓度较高，而且每个泳道中从上到下依次为组蛋白Ｈ３，Ｈ２Ａ／Ｈ２Ｂ，Ｈ４，而且无杂蛋白混合，纯度较高．
２．４ Ｂｉｏｔｉｎ标记检测核小体取组装后样品各１００ｎｇ ＤＮＡ进行Ｂｉｏｔｉｎ标记检测，结果如图３所示，图中０、０．８、１．２分别为组装体系中组蛋白八聚体与ＤＮＡ的质量比．从图中可看出未加组蛋白的泳道仅有ＤＮＡ条带，而加入组蛋白的泳道都分别出现上下两条带，上方的条带为形成的核小体，靠下的条带为未形成核小体的游离ＤＮＡ，与未加组蛋白的对照位置相同．当加入的组蛋白与ＤＮＡ的比例不同时，组装核小体的效率也不同，组蛋白与ＤＮＡ的比例为１．２的条带明显比０．８的条带亮．此外从图中也可以看出，序列ＥＳ１与组蛋白的结合能力差，同样比例条件下形成核小体的能力明显低于６０１序列与ＣＳ１序列．
２．５ ＥＢ染色检测核小体组装后样品利用琼脂糖凝胶电泳检测结果如图４所示，图中０、０．８、１．２分别为组装体系中组蛋白八聚体与ＤＮＡ的质量比．结果与利用Ｂｉｏｔｉｎ标记检测结果类似，在加入组蛋白的样品泳道中，分别出现两条清晰的条带，上面的条带为形成的核小体，下面的条带为游离的ＤＮＡ序列，而且组蛋白与ＤＮＡ的组装比例越大，形成的核小体的条带越深、游离的ＤＮＡ条带越浅．
３讨论
目前，染色质体外组装方式中，相对于依赖ＡＴＰ及蛋白因子（ｄＮＡＰ Ｉ和ＡＣＦ）进行的染色体体外组装，盐透析方法装配染色质系统内只含有组蛋白和ＤＮＡ，不需要加入特殊的蛋白质，因此产生的染色质结构仅依赖于ＤＮＡ序列的核小体定位特性．本实验以６０１序列为模板成功地利用盐透析方法体外组装了染色质结构，并分别运用Ｂｉｏｔｉｎ标记及ＥＢ染色两种不同的方法进行检测．目前一般实验室ＥＢ染色能够检测到的ＤＮＡ至少需要２０ｎｇ以上，所以体外组装核小体结构后，直接ＥＢ染色检测电泳的灵敏度低，而且由于ＤＮＡ序列缠绕到组蛋白八聚体上形成了核小体结构，也会影响ＥＢ嵌入到ＤＮＡ双链中的效率，但是ＥＢ染色检测的方法也相对比较简单，无需其他过程及设备．识别Ｂｉｏｔｉｎ的抗体专一性非常高，样品中只有微量的Ｂｉｏｔｉｎ标记的ＤＮＡ序列存在，该抗体就可以专一性的识别，所以Ｂｉｏｔｉｎ标记检测法灵敏度较高，但检测过程较为复杂，需要进行转膜、抗体识别、底物反应、曝光等操作，费用也较ＥＢ染色昂贵．本工作为研究核小体定位、组蛋白修饰、组蛋白变体等表观遗传问题以及转录因子的结合和转录调控机制等多种生物学过程奠定了基础．致谢：组蛋白的表达、纯化与复性以及八聚体的装配在中国科学院生物物理研究所李国红课题组完成，感谢李国红研究员给予的帮助与指导．
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