环形泰勒虫病又称热带泰勒病，是由泰勒虫属的环形泰勒虫感染牛引起的一类蜱传性血液原虫病（蒋金书，２０００）。本病流行区域广泛，在北美、东欧、北非和亚洲地区均有分布（Ｄｏｌａｎ，１９８９；Ｓｅｒｖｉｃｅ等，２００１），是牛最严重的寄生虫病之一。环形泰勒虫病在中国广泛分布，新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等１９个省区均有报道（吕文祥等，１９９５；Ｌｕｏ等，１９９７）。临床症状主要为食欲不振、发热、浅表淋巴结肿大、心跳过快、呼吸困难、贫血等（汪明，２００８）；急性病例可见白细胞、淋巴细胞减少等典型血液学变化；慢性病例可致乳牛产奶量下降。近年来，环形泰勒虫的发病呈上升趋势，为养牛业的发展带来重大危害。有效的诊断对于减少该病引起的损失至关重要，而传统的血涂片镜检法虽然操作简单、用时较短，但当血液中的虫体数量下降到一定程度时，该法诊断容易漏检，故其准确性远达不到诊断和检测的要求（党志胜等，２００４）。因而选择一种合适的诊断方法显得尤为重要。
分子生物学诊断方法是近年来迅速发展起来的一种诊断方法，在寄生虫病诊断和研究中应用越来越广泛，且分子生物学诊断方法有替代传统诊断方法的趋势，因此利用分子生物学工具对环形泰勒虫进行检测和流行病学调查意义重大。聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）作为一种普遍的分子生物学工具在各类寄生虫病的诊断中应用广泛。
Ｂｉｓｈｏｐ等（１９９２）首次将ＰＣＲ技术应用于泰勒虫病的诊断。Ｏｌｉｖｅｉｒａ等（１９９５）使用裂殖子主要表面抗原（Ｔａｍｓｌ）特异性引物，对采集的９２份牛血样进行了环形泰勒虫的ＰＣＲ检测，检出率为７５％，与血涂片镜检法２２％的检出率和免疫荧光抗体检测４０％的检出率相比，ＰＣＲ检测方法具有灵敏度高的优越性。故ＰＣＲ方法因其良好的特异性和较高的敏感性而广泛应用，不失为环形泰勒虫病诊断的一种好方法。
在应用ＰＣＲ技术检测寄生虫感染时，良好的靶标序列的选择是非常重要的。环形泰勒虫裂殖体表面蛋白（Ｔｈｅｉｒｅｌｉａ ａｎｎｕｌａｔａ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＴａＳＰ）是环形泰勒虫虫体发育阶段分泌出的一种膜内蛋白，其不但具有良好的免疫原性，作为一种关键的分子标记基因，在分子诊断方面同样具有重要的应用价值（Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ等，２００２）。
Ｓａｄｒ－Ｓｈｉｒａｚｉ等（２０１２）研究发现，ＴａＳＰ基因虽然显示出种内和种间的多态性，但不同来源的ＴａＳＰ蛋白有一个共同的保守区，这一特性表明，ＴａＳＰ基因是潜在的分子生物学诊断靶标序列。Ａｌ－Ｓａｅｅｄ等（２０１０）研究结果表明，基于ＴａＳＰ基因建立的ＰＣＲ检测方法可用于环形泰勒虫病的流行病学调查。因此本试验以ＴａＳＰ基因为靶标序列，根据ＧｅｎＢａｎｋ登录的牛环形泰勒虫ＴａＳＰ基因序列保守区设计合成１对引物，建立诊断牛环形泰勒虫病的ＰＣＲ方法。
１材料与方法
１．１虫种与菌株
试验用环形泰勒虫（Ｔ．ａｎｎｕｌａ－ｔａ）、中华泰勒虫（Ｔ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、瑟氏泰勒虫（Ｔ．ｓｅｒ－ｇｅｎｔｉ）、尤 氏 泰 勒 虫 （Ｔ．ｕｉｌｅｎｂｅｒｇｉ）、吕 氏 泰 勒（Ｔ．ｌｕｗｅｎｓｈｕｎｉ）、绵羊泰勒虫（Ｔ．ｏｖｉｓ）、马泰勒虫（Ｔ．ｅｑｕｉ）、驽巴贝斯虫（Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ）、牛巴贝斯虫（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）均由中国农业科学院兰州兽医研究所／虫种资源保藏课题组提供；大肠杆菌ＪＭ１０９购自ＴａＫａＲａ公司。
１．２主要试剂
ｒ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、ＤＮＡ提取试剂盒、质粒提取试剂盒、ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载 体 均 购 自ＴａＫａＲａ公 司；ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常规试剂为进口或国产分析纯。
１．３方法
１．３．１目的基因ＰＣＲ扩增、克隆及测序 根据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的牛环形泰勒虫ＴａＳＰ基因序列（登录号：ＡＹ２７４３２９．１），应用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计合成１对特异性引物，引物序列为：ＴａＳＰ－Ｆ：５′－ＧＡＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＣＴＡＴＣ－３′；ＴａＳＰ－Ｒ：５′－ＴＴＣＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＡＴＣ－３′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取感染虫血３００μＬ，参考基因组ＤＮＡ提取试剂盒进行牛环形泰勒虫基因组的提取。提取的基因组ＤＮＡ置－２０℃保存备用。ＰＣＲ反应体系５０μＬ：１０×Ｂｕｆｆ－ｅｒ ５μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，ｒ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，基因组ＤＮＡ模板１μＬ，上、下游引物（２５ｐｍｏｌ／μＬ）各１μＬ，加灭菌水至终体积 为５０μＬ。ＰＣＲ反 应 条 件 为：９４ ℃预 变 性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸８ｍｉｎ。反应结束后取５μＬ ＰＣＲ产物用１．５％琼脂糖凝胶进行电泳检测。对ＰＣＲ产物利用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒进行胶回收，将回收产物与ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体连接，氨苄青霉素（Ａｍｐ）筛选阳性克隆，将ＰＣＲ鉴定为阳性的克隆质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
１．３．２特异性试验 以环形泰勒虫基因组ＤＮA为试验样本，以环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫基因组为对照检验本试验方法的特异性。
１．３．３敏感性试验 对提取的环形泰勒虫基因组ＤＮＡ模板连续１０倍稀释，使浓度梯度为１００至１０－１１，按照上述反应条件进行ＰＣＲ扩增。
１．３．４临床样品检测 采集甘肃环形泰勒虫病流行区血样１５０份，采集前动物无明显临床症状。采血前耳尖末梢血涂片染色镜检，对采集的血液样本处理后用上述ＰＣＲ方法检测。
２结果与分析
２．１牛环形泰勒虫 ＴａＳＰ基因的扩增及测序结果以提取的牛环形泰勒虫基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，其产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出３９３ｂｐ的目的基因片段（图１），与预期结果一致。将该目的片段胶回收后克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体，转化后，ＰＣＲ鉴定为阳性的克隆质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。经ＤＮＡＳ－ｔａｒ软件 分析，基因序列与设计引物时所选 片 段（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＹ２７４３２９）的相似性为９３．２％（图２）。
２．２ ＰＣＲ特异性试验 用本试验建立的方法对环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫分别进行检测，结果见图３。由图３可知，只有环形泰勒虫能扩增出预期的条带，表明该方法特异性好。
２．３ ＰＣＲ灵 敏 度 试 验 对 环 形 泰 勒 虫 基 因 组ＤＮＡ模板 进 行 不 同 浓 度 梯 度 的 稀 释，当 稀 释 到１０－１０时，依然能检测到目的条带（图４）
２．４临床样本的检测 对甘肃省肃北县牛环形泰勒虫病流行地区采集的１５０份血液样本进行ＰＣＲ扩增和血液涂片镜检，阳性率为２６％（３９／１５０），而血涂片染色镜检的阳性率仅为５．３％（８／１５０）。
３讨论
环形泰勒虫病是严重危害牛的一种寄生虫病，近年来随着养牛业的发展和牛的频繁交易，环形泰勒虫的流行区域在逐渐扩大，发病率也随之升高，给养牛业带来了巨大损失。目前中国对环形泰勒虫病的诊断主要还是依靠血涂片染色检查。虽然血涂片染色镜检方法方便快捷、应用较广，但当环形泰勒虫隐性感染和红细胞染虫率较低时，检测较为困难。同时由于血涂片制作及染色技术等原因，常规血涂片染色方法敏感率较低，常出现误诊。因而利用基因工程技术建立分子生物学诊断方法不失为一种好的选择。
ＰＣＲ是在体外模拟ＤＮＡ自我复制的核酸扩增技术，与其他诊断方法相比，ＰＣＲ方法特异性强、敏感度高，目前已广泛应用于疾病的诊断。据报道，ＰＣＲ的灵敏度为１μＬ血样中１个梨形虫，因而建立环形泰勒虫ＰＣＲ诊断方法有很大的应用价值（Ｋｉｒｖａｒ等，１９９８）。据报道，环形泰勒虫ＰＣＲ诊断方法较好的靶标序列是核糖体ＲＮＡ（１８ＳｒＲＮＡ）（罗金等，２０１１；Ａｄａｍ，２００１）基因序列。大量研究结果表明，一些保守的抗原基因在候选诊断抗原方面具有重要的潜在应用价值（罗金等，２０１２；王轶男等，２０１２）。因此，以潜在抗原蛋白为目标序列建立的一系列诊断方法得到了广泛的应用。
ＴａＳＰ基因是利用抗裂殖体免疫血清筛选环形泰勒虫ｃＤＮＡ表达 文 库 得 到 的 一 种 单 拷 贝 基 因 （Ｓｅｉｔｚｅｒ等，２００７），在孢子体和裂殖体阶段表达，具有较好的免疫原性，同时该蛋白基因是高度保守的，因而可作为诊断和预防环形泰勒虫病的理想抗原。
本研究以环形泰勒虫ＴａＳＰ基因序列保守区设计１对特异性引物，建立了环形泰勒虫病原体ＰＣＲ诊断方法。本试验将ＰＣＲ产物克隆测序后，显示该基因序列为环形泰勒虫高免疫原区片段。利用该片段作为检测序列，以中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫的基因组作为对照，均没有特异性条带出现。同时将环形泰勒虫基因组模板倍比稀释，当稀释度达到１０－１０时，依然能检测到目的条带的出现，说明本试验建立的ＰＣＲ检测方法具有特异性高、敏感性好的特点。
利用本试验建立的方法和血涂片法对甘肃省肃北县牛环形泰勒虫病进行检测，对收集的１５０份牛血样检测显示，ＰＣＲ诊断方法的阳性率为２６％（３９／１５０），高 于 血 涂 片 染 色 镜 检 的 阳 性 率５．３％（８／１５０），两者 符 合 率 为１００％。表 明 本 试 验 建 立 的ＰＣＲ诊断方法具有一定的可靠性和准确性。本试验建立的ＰＣＲ诊断方法为环形泰勒虫病的快速诊断提供了条件，也对环形泰勒虫的鉴别诊断及分子流行病学调查具有重大应用意义。
参 考 文 献
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