大豆性状改良中转基因技术的运用(2),基因工程论文

　　2 转基因技术在大豆性状改良上的应用

　　2. 1 抗除草剂转基因大豆

　　现代农业中除草剂的广泛使用显着地节约了劳动力、提高劳动效率，但除草剂在消除杂草的同时也不同程度地伤害农作物、污染环境，这将不利于农业生态的长远发展。结合转基因技术将抗除草剂基因转入大豆等农作物中，可高效地解决除草剂的安全问题。目前国际上转基因大豆主要有抗除草剂 Glyphosate（草甘膦）和 Glufosinate（草丁磷）的两种。草甘膦是一种高效广谱的除草剂，它对植物中的 EPSPS（ 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶）有专一抑制作用，阻断芳香族氨基酸的生物合成，从而扰乱植物体的正常氮代谢而致其死亡[25].目前理论上通过转基因手段造成作物对草甘膦产生抗性的策略有：（ 1）植物内源编码 EPSPS 蛋白基因的超表达；（ 2）导入能够降解草甘膦的基因；（ 3）导入与草甘膦亲和性下降的 EPSPS 蛋白的编码基因。

　　Widholm 等[26]通过悬浮培养体细胞胚，获得了超表达内源 EPSPS 基因的转基因大豆。美国 Monsanto（孟山都）公司研发的 Roundup Ready Soybean（抗草甘膦转基因大豆）是世界上最早获得推广的抗除草剂转基因大豆，并于 1996 年获准商业化生产，成为世界上最早获准推广的转基因作物。RoundupReady Soybean 的发展更便于实施免耕以及更利于窄行密植，这种优势使得其大面积的种植和大范围的推广。Bayer Crop Science（拜耳作物科学公司）研发了另一转基因作物 Liberty Linksoybean（抗草丁磷转基因大豆）[27].Liberty Linksoybeans 表达的是一种从链霉菌（ Streptomyces viridochromogenes）中分离出的 PAT （草丁磷-N-乙酰转移酶）基因。PAT是一种谷氨酰胺合成酶抑制剂，可以使植物抵抗广谱型的草丁磷除草剂。有些学者将抗两种不同除草剂的基因（抗草甘膦和抑制乙酰乳酸合成酶除草剂基因）转入大豆中，这种转基因大豆表达草甘膦乙酰转移酶（ GAT4601）并且修饰乙酰乳酸合成酶（ GM-HRA）蛋白[28].GAT4601 蛋白对草甘膦有抗性，GM-HRA 蛋白表现出对抑制乙酰乳酸合成酶除草剂的抗性。与之前的单基因控制的单一性状转基因大豆相比，这种多基因导致的抗两种除草剂特性的转基因大豆采用了不同的处理方法，其作用机制也存在差异。Syngenta （先正达）公司和 BayerCrop Science 公司共同研制了一种新性状的抗 HP-PD 抑制剂的转基因大豆。 Hydroxyphenylpyruvatedioxygenase（ HPPD）抑制剂使植物中的质体醌生物合成受阻，从而影响光合作用、类胡萝卜色素合成以及维生素 E 合成，导致叶绿素被破坏和杂草白化[29].Giani 等[30]研究了草甘膦对抗草甘膦转基因大豆产量、固氮作用和籽粒品质的影响，结果发现转化型大豆并没有影响土壤微生物群、生物固氮作用、产量以及籽粒中的异黄酮含量，但即使在推荐应用剂量下，种子中的草甘膦含量仍偏高，并且能在土壤和籽粒中检测出磷酸残留。我国抗除草剂基因工程研究起始于 20 世纪 80 年代，岳绍先等[31]将从龙葵中得到的抗 Atrazine（阿特拉津） psbA基因导入大豆叶绿体基因组中得到表达并能遗传到后代，这是我国最早的转基因抗除草剂作物。Liu等[32]成功的利用农杆菌介导的子叶节转化法获得了 4 株抗除草剂的转化植株，并且所有的植株都有较好的产量、gus 和 bar 基因表型以 3∶1 比率传递给后代植株。当然，未来新的分子技术发展将使得转基因大豆获得更新更强的抗杂草特性，沿着减少对环境的污染，提高生物安全性以及降低大豆消费者和生产者成本的方向发展。

　　2. 2 转基因抗虫大豆

　　采用农药防治害虫已经取得了显着的效果，但同时广泛大量使用农药又会导致环境恶化、危害人类和其他物种的健康，同时减少环境中的有益昆虫数量，增强害虫的抗药性等等一系列危害，这将不利于生态环境的可持续发展。我国北方是主要的大豆生产区，而大豆食心虫（ Leguminivora glycini-vorella Mats. ）对大豆危害极其严重，虫食率高达10% ~ 20%[33].大豆食心虫属于鳞翅目（ Lepidop-tera）、小卷蛾科（ Tortricidae） ,其幼虫以大豆的豆荚和籽粒为食，导致碎粒和生成虫口，因而降低大豆产量，影响籽粒品质。所以抗虫转基因大豆是虫害育种中新的突破。大豆抗病虫基因主要有两类，一类是苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thringiensis,简称 Bt）分离出的 Bt 基因。苏云金芽孢杆菌在形成芽孢过程中产生一种杀虫晶体蛋白（ insecticidal control pro-teins,ICPs）或 δ-内毒素（ δ-endotoxin）的杀虫伴胞晶体蛋白，这类蛋白对鳞翅目、鞘翅目（ Coleoptera）、双翅目（ Diptera）等多科昆虫具有杀伤力，使其不能进食而死亡。另一类是来源于高等植物蛋白酶抑制因子的基因，具有抗虫谱广的特性，这些基因对人体无副作用并且害虫不易产生耐受性，其中抗虫效果最理想的基因是豇豆胰蛋白酶抑制剂（ CpTi） .豇豆胰蛋白酶抑制剂是由约 80 个氨基酸组成的多肽，产物抑制昆虫消化道中的消化酶，使昆虫因不能消化吸收营养物质而死。Parrott 等[34]用携带有Bt 内毒素蛋白基因和 CpTi 基因微弹轰击各种基因型大豆品种的胚型悬浮系，获得三个转 Bt 内毒素蛋白基因的大豆细胞系并已得到再生植株。Stew-art[35]将合成的 Bt 晶体蛋白基因（ cry IAc）构建进入pSG3525 质粒中获得 pSG / BT 载体，通过基因枪轰击感虫品种 Jack 的悬浮培养球形体细胞胚，经过潮霉素筛选得到 3 个转基因株系。Walker 等[36]三年内在大田中使用铁笼和人工侵染鳞翅目幼虫的方法比较转 Bt 基因大豆与对照大豆的抗虫性，结果是对照大豆的落叶率比转 Bt 基因大豆的落叶率高 9倍。Mcpherson 和 MacRae 等[37]也做了相似的实验，通过控制鳞翅目种类评估转 Bt 基因大豆抗虫性，两年比较实验得出，表达 Cry1Ac 基因的大豆与对照相比鳞翅目的昆虫数量大大减少，而对照中幼虫数目最多达到每行 20 ~30 只。转 Bt 基因大豆落叶率 <1. 5%,对照中落叶率达到53%,转 Bt 基因大豆的百粒重和产量也未受到影响。国内很多学者深入研究了抗虫转基因大豆，徐香玲等[38]以 Ti 质粒为介导，把 Bt 内毒素蛋白基因导入大豆获得抗大豆食心虫的新类型。南相日等[39]利用 PEG 法将 Bt毒蛋白基因导入大豆原生质体中，经筛选检测获得再生植株。据报道，利用花粉管通道技术可将抗虫基因导入到大豆中，获得再生植株，经检测后证明，外源基因被整合到大豆基因组中[40-42].虽然抗虫转基因大豆的研究取得了较好的效果，部分转化植株的抗虫能力可以稳定遗传[43-45],但由于受基因型限制，以及易产生嵌合体等原因，高代转化植株中的外源基因易丢失，稳定遗传效果差，有关转化后高代植株的基因稳定性遗传的报道还比较少。目前，商业化生产的抗虫转基因大豆几乎都是转 Bt 基因，抗虫转基因大豆也存在一定缺陷，主要是每种抗虫蛋白的抗虫谱仅局限于几种特定的昆虫，同时昆虫对抗虫蛋白也会产生耐受性，将 Bt 基因与其他抗性基因结合转化到大豆中可减少化学农药的消耗，多基因共转化策略在将来大豆抗虫性研究中越来越重要。

　　2. 3 抗病性增强的转基因大豆

　　大豆花叶病毒（ soybean mosaic virus,SMV）、大豆疫霉菌（ Phytophthora sojae Kaufmann & Gerde-mann）、大豆灰斑病（ Cercospora sojina Hara）、大豆孢囊线虫（ soybean cyst nematode,SCN）等是危害大豆生产的重要病害[46-48],这些病害可以从籽粒、根部、茎叶、豆荚及特定的组织侵染植株，从而严重影响大豆的产量和品质。为有效控制病害，在传统育种中多采取改良耕作的方式，例如，筛选耐荫品种、宽行种植及与无病害植株循环种植等手段，其效果并未尽如人意。当然也可采取一下化学防治方法，但考虑其低渗透、喷洒不均匀、高投入及对环境不利等因素也并不是理想的方法。因此，研究抗病毒的转基因大豆对于提高大豆抗性，增加产量具有重要意义。Abel 等[49]利用烟草花叶病毒（ Tobacco mosa-ic virus,TMV）外壳蛋白基因（ CP ） ,首次获得抗TMV 的转基因烟草植株。自此以来，研究抗病毒转基因植物的策略不断被提出，包括外壳蛋白基因介导的抗性、复制酶介导的抗性、病毒运动蛋白介导的抗性、利用缺陷干扰性分子介导病毒抗性等。大豆抗病虫主要是利用转入外壳蛋白基因获得对病毒的抗性[50].随后，Di 等[51]利用农杆菌介导法把豆荚斑点病毒外壳蛋白前导基因（ BPMV-cp-p）转化到大豆子叶节中，获得 5 个转化植株，经检测后部分转基因植株后代表现对 BPMV 抗性，同时获得纯合系。Tougou 等[52-53]通过插入大豆矮病毒的外壳蛋白基因（ soybean dwarf virus,SbDV）获得了抗 SbDV大豆植株。之后他们又将 SbDV 反向重复序列的CP 基因用 β-葡萄糖醛酸酶序列隔开，利用 RNA 沉默来得到 SbDV 抗性，感染病毒试验后转基因植株1抗性植株。在抗真菌病转基因大豆研究上，Cunha等[54]获得过表达草酸脱氢酶（ OXDC）的抗茎腐病（ Sclerotinia stem rot ,SSR）转基因大豆株系。几丁质酶（ chitinase）主要水解几丁质多聚体中的 β-1,4糖苷键，当植物受到真菌、细菌和病毒感染时，几丁质酶的活性就会迅速提高，与植物对病原微生物的抗性密切相关[55].Li 等[56]将多种抗真菌的基因转入大豆中来获得多基因抗性，并且成功获得过表达几丁质酶（ CHI）和大麦核糖体灭活蛋白（ RIP）两种抗性的转基因大豆。利用生物技术手段，植株可以产生双链小 RNAs （ dsRNAs）使线虫基因沉默。Steeves 等[57]首次应用 RNAi 防治大豆孢囊线虫病，他将包含大豆孢囊线虫的主要精子蛋白域（ majorsperm protein,MSP）的 cDNA 克隆反向重复序列的RNAi 表达载体转移到大豆中，导致大豆孢囊线虫的生殖率降低 75%.随后 Li 等[58]利用 RNAi 原理检测有关大豆孢囊线虫繁殖力和适应力的潜在基因（ Cpn-1、Y25、Prp-17 基因） .近年来 Ibrahim 等[59]用RNAi 原理断裂大豆根结线虫形成基因减少大豆根部危害。Andrea 等[60]利用基因过表达和 RNAi 原理检测植物抗病性主要蛋白 NPR1 的抑制因子（ SCN1、SNI1）对大豆和拟南芥的抗孢囊线虫病性，结果表明 SCN1 基因过表达和 SNI1 基因沉默可有效降低雌性线虫数量。在国内，刘德璞等[61-62]利用花粉管通道技术将大豆导入抗 SMV 的基因，结合常规育种程序，获得遗传稳定的抗病丰产品系。郭玉双等[63]以东北地区主栽大豆品种为材料，利用农杆菌介导法，将几丁质酶基因和核糖体失活蛋白基因转入受体材料，Southern 检测到同时整合双价基因的 T0代转基因植株，转化频率为0. 5%,扩繁至 T2代后，经抗性检测以及分子生物学检测表明，外源基因已在大豆株系中表达。张云月等[64]把具有广谱抗病性的 hrpZpsta 基因利用农杆菌介导的方法导入大豆植株，获得 hrpZpsta 基因遗传表达的 T3代抗灰斑病的转基因大豆株系。在防治大豆病害上，RNAi技术在降低线虫的繁殖率和传染率，以及在根源上提高大豆的抗性将发挥越来越大的作用。