基因工程论文
花生（Arachis hypogaea L.）是世界主要油料作物，也是重要的植物蛋白来源，其种子含脂肪50%左右，含蛋白质约 25%.花生原产南美，其种植地区主要分布在亚洲、非洲和美洲，其中亚洲约占 60%,非洲约占 30%,美洲约占 5.5%.中国是世界第一花生生产和消费大国，与国内其他油料作物相比，花生在单产、含油量、单位面积产油量、种植效益、国际竞争力等方面具有明显的优势，使之成为最具发展潜力的油料作物之一。
稳定提高花生产量，改进花生抗逆性和营养品质，是花生遗传改良的重要方向与目标。基因工程为利用更广泛的基因资源进行花生遗传改良提供了新的手段，可以通过外源基因导入及遗传调控技术途径提高花生的抗逆性和改良花生的营养品质，同时，花生基因工程技术的发展也显示出花生在生物反应器方面的潜在应用价值.
许泽永等（2007）曾对转基因花生研究进展进行了评述，近年来，在花生再生体系的研究取得较大进展的基础上（Chu et al., 2008a; Bhatnagar et al., 2010）,在利用基因枪、农杆菌介导的目的基因遗传转化方面又有许多新的研究报道，常用的转化方法主要有三类，一是基因枪法转化胚性愈伤组织，通过体胚发生途径分化再生；二是农杆菌介导转化胚小叶、子叶（节）或胚轴外植体，通过体胚发生或器官发生途径分化再生；三是农杆菌介导转化茎尖外植体，直接发育成苗.目的基因主要包括提高对病毒、真菌、干旱、抗除草剂等抗性基因，在降低过敏原、高油酸等营养品质改良和生物反应器生产免疫产品等方面也开展了应用研究.本文结合本实验室的相关研究工作，根据转化的目的基因类型，对近年来花生基因工程研究新进展进行综述，并对不同的转化方法及其效果进行比较分析，以助花生基因工程研究工作的进一步深化.
1 花生的遗传转化方法
1.1基因枪法
Ozias-Akins等（1993）利用基因枪法将含 CaMV35S 启动子的 hph 载体转化花生幼胚，轰击后 4~5 周在含5~10 mg/L 潮霉素的培养基上筛选 2 轮选择抗性愈伤，再通过20 mg/L 潮霉素液体培养基筛选，Southern 杂交证实了 hph 基因的整合，转化率（转化细胞系/ 轰击愈伤数）为 1%.后续该实验室利用该体系进行了多次遗传转化方法改进及应用，建立了基因枪转化重复发生胚性组织的方法。Deng 等（2001）用基因枪法通过未成熟子叶体细胞胚胎发生途径获得转hpt和gus基因植株。Joshi 等（2005）将绿色荧光蛋白（GFP）作为花生遗传转化的非破坏性标记，构建了 CaMV 35S 启动子控制的增强 GFP （EGFP）和黄色荧光蛋白（EYFP）基因载体。利用基因枪法转化Georgia Green 品种，通过与双 35S 启动子控制的具有AMV 增强子序列的载体 p524EGFP.1 进行比较，表明p524EGFP.1 和 pEYFP 的表达能检测到较强的荧光信号，但与潮霉素相比，选择效率较低.Chu 等（2013） 在改良基因枪转化方法中用精蛋白代替亚精胺、并将每枪 700 ng DNA 降到 70 ng,转化效率提高了 4.6 倍，但转基因拷贝数也有显着提高。
1.2根癌农杆菌介导法
1.2.1幼叶外植体的转化
Eapen和George （1994）报道了农杆菌介导的花生叶盘转化方法，Southern杂交证实了NPTⅡ 和 GUS基因的整合，但后代结实性差，没有转基因后代的遗传分析.Cheng等（1997）报道，以花生10 d幼叶为外植体，培养于高浓度的细胞分裂素（25 mg/L BA）、低浓度生长素（1 mg/L NAA）培养基，与EHA 105菌株共培养2 d,7 d后进行抗生素筛选（150 mg/L卡那霉素）,生根培养基添加50 mg/L卡那霉素.与烟草叶片提取液共培养提高了GUS的瞬时表达活性.叶片外植体转化率约为0.3%.在 T2转基因花生植株中，GUS基因表达证实外源基因已整合到花生基因组并稳定表达。
1.2.2子叶外植体的转化
Sharma和 Anjaiah （2000）用农杆菌 C58 菌株转化成熟种子子叶外植体，基本培养基附加4.5 mg/LBA和 2.2 mg/L 2,4-D.2 周后用 125 mg/L 卡那霉素选择，生根培养基不添加抗生素.诱导率和转化率分别达到90%和 55%.后代 Southern 杂交显示，8 株有nptⅡ的单拷贝。其后，该方法应用于花生从簇病毒外壳蛋白基因的转化，在部分转化体中检测到1 个拷贝，至少一个转化体表现出孟德尔遗传.Swathi A-nuradha 等（2006）利用 JL-24 子叶节进行农杆菌介导的花生遗传转化，在MS 培养基附加 4 mg/L 2,4-D和0.1 mg/LNAA,与农杆菌 GV2260 共培养 3 d,4 d恢复培养后，用175 mg/L 卡那霉素筛选，诱导率达到45%,转化率 31%,3.54%的转化植株表现转化基因的稳定整合.Bhatnagar 等（2010）进行无选择标记载体的转化JL24 子叶外植体，获得经 Southern 证实的转化后代.诱导率 32%~48%,转化率 75%.
1.2.3 活体分生组织的转化
Entoori 等（2008）应用农杆菌介导的活体茎尖分生组织体转化方法，利用发芽种子胚轴接种农杆菌，然后直接成苗。获得整合 Bt 基因 cry1X 的植株，并经 Southern 杂交得以证实。
2 目的基因转化及目标性状改良
2.1提高病毒病抗性
Higgins等（2004）以成熟种子胚性愈伤为外植体，利用基因枪法转化病毒外壳蛋白（CP）基因，获得对花生条纹病毒（PStV）高抗的花生。其抗性机制表现为RNA 介导抗性，表现抗病或免疫（没有病毒复制）的转化植株中检测不到抗性蛋白的表达。而且在转CP2 的 T0植株中检测到转基因特异的小 RNA.这些材料可为花生育种提供重要的抗性资源.Mehta 等（2013）通过农杆菌介导转化子叶和幼叶将烟草条纹病毒（TSV）外壳蛋白（CP）基因转入花生品种K6和K134,获得抗性植株，PCR证实了T1、T2和T3的转基因整合.单拷贝转基因T3纯系接种试验，植株未显病症，几乎没有病毒积累，表明对病毒侵染具有抗性.RT-PCR实时定量PCR和ELISA证实了CP基因的表达.这项研究为创造花生茎疽病抗性材料提供了有效途径.
2.2提高抗虫性
徐平丽等（2003）以成熟花生胚轴为受体，通过农杆菌LBA4404 的侵染，将豇豆胰蛋白抑制剂（CpTI）基因转入花生.PCR 检测及 Southern 杂交鉴定证实外源基因的整合.通过抗虫性检测试验，转基因花生具有一定的抗虫性.Entoori 等（2008）利用农杆菌介导的非组培方法（茎尖）将 Bt 基因 cry1X 转入花生品种 TMV-2,生物检测表明，T1植株对花生两种主要害虫棉铃虫和斜纹夜蛾具有抗性。ELISA 检测证实了转基因的表达，Southern 分析证实了转基因的整合。
Tiwari 等（2008）将 35S 启动子驱动的 δ- 内毒素Cry1EC基因通过农杆菌介导花生子叶转化，获得Southern 杂交证实的 T0单拷贝转基因植株，实时定量PCR、Western 杂交和 ELISA 分析证实单拷贝 T1植株中Cry1EC的高表达，免疫测定表明Cry1EC的表达高达T1可溶性蛋白的 0.13%.饲叶试验表明高表达转基因植株的斜纹夜蛾二龄幼虫致死率为100%.Tiwari 等（2011）将病程响应启动子 PR-1a 驱动的δ- 内毒素Cry1EC基因用相同的转化方法转化花生，选择非诱导表达非常低、在种子中不表达的转化株进行试验，水杨酸诱导后，Cry1EC在叶片中的表达量提高近 8 倍，水杨酸处理及斜纹夜蛾取食叶片在 2 d 后表达量达到最大。水杨酸诱导转基因植株叶片对各龄幼虫的致死率均达100%.