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甘薯抗病基因的克隆与育种展望

来源:学术堂 作者:韩老师
发布于:2015-12-11 共3814字

  甘薯(Ipomoea batatas Lam.)原产于南美洲,是重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源用块根作物,目前我国每年种植面积近 500 万亩, 年总产量占世界甘薯产量的 80%. 然而近年来,由于种薯种苗的频繁调运和检疫技术的不完善而导致其病虫害加重,给甘薯产业的发展造成了很大威胁。 甘薯病害主要包括真菌病、细菌病和病毒病等,开发和利用寄主本身的抗病性是解决病害问题最根本且有效的途径,1甘薯遗传上高度杂合且存在种间、 种内杂交不亲和现象,这些都加大了通过常规育种来选育优质、高抗甘薯品种的难度。 随着分子生物学技术的发展,运用转基因技术进行植物品种改良已成为现实,这也为作物抗病育种开辟了新的途径, 而获得优良抗病基因是实现这一目标的前提和基础, 因此对甘薯抗病基因的相关研究显得尤为重要。

  1 甘薯主要病害的分布及特征、特性

  1.1 我国甘薯主要病害区的分布

  我国北方薯区以甘薯根腐病、甘薯黑斑病、甘薯茎线虫病等为主;南方薯区以疮痂病、蔓割病、薯瘟病、 蚁象危害为主; 长江中下游薯区地处南北交接处,在甘薯病害的表现上多为:离南方薯区近的地方病虫害多与南方薯区相同, 离北方薯区近的地方病虫害多与北方薯区相同, 中间地带则多为贮藏期病害,[1]具体调查结果见表 1.

  1.2 甘薯主要病害的特征、特性

  甘薯黑斑病又称黑疤病, 在我国各地均有发生, 是造成甘薯烂窖、 烂床、 死苗的主要原因。 其最适发病温度为 25℃, 病菌多从伤口侵入。 一般地势低洼、 阴湿、 土质粘重的地方发病较严重, 可通过轮作倒茬、 培育无病壮苗、 药剂处理种薯等方法来进行防治。

  甘薯根腐病多发生在北方薯区, 但近年来有向长江流域以南传播的趋势, 给甘薯生产造成极大危害[2]. 该病害为典型土传病害,带菌种苗是远距离传播的重要途径, 发病最适温度为 27℃左右, 连作地、沙土地及土壤含水量在 10%以下的地带易诱发此病,且发病较严重[3-5]. 可通过培育抗病品种 \ 辅助轮作换茬、适时早栽等农业措施来加以防治。

  甘薯茎线虫病又叫空心病, 是国内植物检疫对象之一,其主要危害甘薯块根、茎蔓及秧苗,块根症状分糠心型、糠皮型和混合型 3 种;茎部症状多出现在髓部,起初为白色,后变为褐色干腐状;秧苗根部受害,在表皮上生有褐色晕斑,秧苗会发育不良、植株矮小发黄。 一般丘陵旱地、沙质壤土、连作地等发病严重。 可通过选育抗病品种、加强检疫、合理用药等方法来进行防治。

  甘薯瘟病又名甘薯细菌性萎蔫病, 是一种毁灭性病害,也是我国的检疫对象之一,其在甘薯各生育期均可发病,表现的症状却不一样。 该病菌主要破坏组织的维管束,使水分和营养物质无法正常运输,其发病最适温度为 27℃~35℃。 病苗、病薯、带菌土、肥料和流水等均可传播。 可通过严格检疫、合理轮作、选用抗病品种等方法来进行防治。

  甘薯蔓割病又名甘薯枯萎病、茎枯病等,为土传性病害。 该病在茎蔓、薯块上均能发病,病菌从伤口侵入,沿导管蔓延,病株叶片自下而上发黄脱落,最后全蔓枯死。 该病害发生适宜温度 27℃~30℃。 可通过选育抗病品种,结合轮作换茬、拔除病株等农业措施来防治。

  甘薯蚁象主要分布在长江以南地区,目前已列为国内检疫对象之一。成虫和幼虫嗜食薯块,造成伤口,病菌同时感染造成腐烂。 该虫一年多代且世代重叠,防治起来较困难。 目前采用的防治方法主要有:消灭虫源、水旱轮作、及时培土、药液浸苗、毒饵诱杀等。

  2 甘薯抗病基因的克隆、分析

  2.1 植物抗病基因的分类

  自 1992 年克隆到第一个植物抗病基因 HmⅠ以来,目前已分离获得 40 多个抗病基因,虽然这些抗病基因来自不同的作物、针对不同的病害,但它们编码的蛋白产物在结构上有很多的相似性, 如它们的蛋白产物含有核苷酸结合位点(NBS)、富亮氨酸重复(LRR)、跨膜结构域 (TM)、TolI-白介素-l 区域 (TIR)等一些相同的结构域[6]. 最终将植物抗病基因大致分为 6 类, 分别为:NBS-LRR 类、LRR-TM 类、LRR-TM-激酶类、Ser-Thr 激酶类、灭活毒素类功能酶及其他类[7].

  2.1.1 NBS -LRR (nucleotide binding site plusleucine-rich repeat)类 NBS-LRR,即 核苷酸结合位点与富含亮氨酸的保守序列构成的蛋白产物, 该类是目前已知的抗病基因中存在最为广泛的, 目前已被成功克隆出的植物抗病基因中的大部分均属于该类, 其基本可分为 3 个小类:LZ-NBS-LRR 类、TIR-NBS-LRR 类和 NBS-LRR 类基因[8].

  2.1.2 LRR-TM 类 LRR-TM 类,即胞外亮氨酸富集重复跨膜受体蛋白。 该类基因所编码的蛋白多为糖蛋白受体, 可锚定在细胞膜上。 这类蛋白一般由3 个部分组成,即:胞外 LRR 结构域、跨膜区域及一个较小的胞内区域[9].

  2.1.3 LRR-TM-激酶类 LRR-TM-激酶类, 即指胞外亮氨酸富集重复跨膜受体激酶类。 在其产物中,既含有胞外 LRR 跨膜螺旋结构受体结构域, 又含有胞内的蛋白激酶结构域[10]. 这两个结构域之间还存在一个跨膜区, 从水稻基因组中克隆出的抗白叶枯病基因即属于该类。

  2.1.4 Ser-Thr 激酶类 Ser-Thr 激酶类, 即丝氨酸/苏氨酸激酶类。 其特点为产物是丝氨酸和苏氨酸激酶,并不具有 LRR 结构域[11]. 这类基因需要对丝氨酸/苏氨酸旳残基进行磷酸化处理后才可以进行抗性反应[12]. 典型的例子是番茄的 Pto,Fen,Lr10 等基因。

  2.1.5 灭 活毒素类功 能 酶 灭活毒素类功能酶 ,又称毒素还原酶类抗病基因, 该类基因产物是一类还原酶,该类还原酶能辅助还原型辅酶 II (NADPH)发挥作用,从而导致病原微生物所产生的毒素失活,以达到抗病的目的。 人类最早克隆出的植物抗病基因玉米 HmⅠ就属于该类。

  2.1.6 其他类 除以上几种常见类型外, 植物抗病基因还有其他的存在形式,如大麦抗白粉病基因 Mlo并不属于上述几类, 也没有与上述几种类型抗病基因相类似的结构与产物, 但却能对大麦白粉病菌产生抗性,保护植株不受侵害[13],而这种形式的抗性反应在水稻等作物中也同样存在[14],有人将其归属于调控因子类。

  2.2 抗病基因的克隆、分析

  王钰[15]克隆了甘薯抗病基因的同源序列(RGA),结果发现克隆所得到的 342 个不同的甘薯 RGAs 与已知的抗病基因 L6、N、RGC1 等具有高度同源性,并利用 Cluxtalw 软件将其分为 22 个不同的类群。 在342 个 甘薯 RGAs 中 , 除 7 个 是 TIR 外 , 其 余属于non-TIR 类 型 , 这 2 个 类型是在 NBS-LRR 类 型的RGA 中 根据 TIR 的 有无而划分产生的 , 即 TIR -NBS-LRR 和 NO-TIRNBS-LRR 两类 RGA (简称 TIR和 non-TIR)。目前 TIR 仅在双子叶植物中被发现,如拟南芥的 RPM1 及 RPS2;non-TIR 在单、双子叶植物中均被发现存在[16-17].

  陈观水[18]从抗根结线虫病甘薯品种青农 2 号和近缘野生种三浅裂野牵牛基因组 DNA 扩增出 28 条RGAs(其中甘薯 22 条,三浅裂野牵牛 6 条),序列分析表明,28 条 RGAs 编码的氨基酸绝大部分含有 P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a 等保守性结构域和疏水结构域(HD),而这些是典型的 NBS-LRR 类抗病基因所拥有的,其中部分还与马铃薯 Grol-4 基因、番茄 Mi-1、Mi-2、Hero、拟南芥 RPM1 等植物 R 基因具有很高的相似性,说明这些 RGAs 有可能为甘薯抗病基因部分片段。 并且初步认为甘薯 SPR1 基因为 non TIR-NBS-LRR 类抗病相关基因。

  SGT1 是 近年来发现的一种植物抗病调控相关基因,其功能是能够调控着丝粒的装配,并调节泛素对目标靴蛋白的修饰[19],随后在很多植物和动物中均发现了该基因[20]. 很多研究表明,SGT1 基因与多种植物的抗病反应相关,目前为止在拟南芥、烟草、水稻、小麦和大麦等农作物中均已发现 SGT1 基因的存在。柏洁[21]以甘薯 RNA 为模板,成功获得了甘薯 SGT1 基因的全长序列信息,且该基因在甘薯的根、茎、叶中均有表达,未表现出明显的组织特异性。

  3 甘薯抗病育种后续展望

  目前采用常规育种方法选育甘薯抗病品种存在周期长、效率低等缺点,而将生物技术与常规育种方法相结合是培育抗病品种最有效的途径。 因为甘薯基因组的复杂性, 目前对其抗性基因方面的研究较少,今后可利用已知抗病基因保守结构域的特性,设计简并引物来获得甘薯抗病基因同源序列 RGAs,而这些 RGAs 可作为候补抗性基因来定位、克隆抗病基因,它同样也可应用于分子标记辅助选择育种。

  但 RGA 技术的应用也存在一些问题和局限性,如 R 基因具有多个保守区域,利用不同保守区域设计引物所得到的 RGA 产物不同,因此保守区域的选择显得尤为重要,一般来讲 LRR 和 NBS 结构域的保守性较强,目前大多应用此保守结构域来设计引物,但有些非抗性基因同样具有 NBS、LRR 和丝氨酸/苏氨酸激酶等保守结构域,因此克隆出的 RGAs 未必都与R 基因有关。对 RGA 而言,它在基因组中以多拷贝形式存在,而且是呈簇状分布,很难将它们有效分开,这给克隆和定位 R 基因带来困难[6]. 针对这些问题,今后可利用从亲缘关系较近的植物中扩增出的 RGA为探针进行盯 RFLP 作图; 根据 RGA 序列设计特异性引物将其转换为 CAPS 标记,用于选择抗病品种以及将 R 基因通过基因渐渗的方式导入性状优良的品种中等措施来进行改善[22-23].

  参考文献
  
  [1]谢逸萍,孙厚俊,等。中国各大薯区甘薯病虫害分布及危害程度研究[J]. 江西农业学报,2009, 21(8):121 -122.
  [2]李鹏,马代夫,等。甘薯根腐病的研究现状和展望[J].江苏农业科学,2009(1):114-116.
  [3]江苏省农业科学院,山东省农业科学院。中国甘薯栽培学[M].上海:上海科学技术出版社, 1984.
  [4]邬景禹,郭小丁,方树民,等。甘薯根腐病的认识及防治措施[J].福建农业科技,1993(2):30.
  [5]闫加启,李淑英。甘薯根腐病的发生与防治[J].北 京农业,2006(12):41.

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