基因工程论文
甘薯（Ipomoea batatas Lam.）原产于南美洲，是重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源用块根作物，目前我国每年种植面积近 500 万亩， 年总产量占世界甘薯产量的 80%. 然而近年来，由于种薯种苗的频繁调运和检疫技术的不完善而导致其病虫害加重，给甘薯产业的发展造成了很大威胁。 甘薯病害主要包括真菌病、细菌病和病毒病等，开发和利用寄主本身的抗病性是解决病害问题最根本且有效的途径，1甘薯遗传上高度杂合且存在种间、 种内杂交不亲和现象，这些都加大了通过常规育种来选育优质、高抗甘薯品种的难度。 随着分子生物学技术的发展，运用转基因技术进行植物品种改良已成为现实，这也为作物抗病育种开辟了新的途径， 而获得优良抗病基因是实现这一目标的前提和基础， 因此对甘薯抗病基因的相关研究显得尤为重要。
1 甘薯主要病害的分布及特征、特性
1.1 我国甘薯主要病害区的分布
我国北方薯区以甘薯根腐病、甘薯黑斑病、甘薯茎线虫病等为主；南方薯区以疮痂病、蔓割病、薯瘟病、 蚁象危害为主； 长江中下游薯区地处南北交接处，在甘薯病害的表现上多为：离南方薯区近的地方病虫害多与南方薯区相同， 离北方薯区近的地方病虫害多与北方薯区相同， 中间地带则多为贮藏期病害，[1]具体调查结果见表 1.
1.2 甘薯主要病害的特征、特性
甘薯黑斑病又称黑疤病， 在我国各地均有发生， 是造成甘薯烂窖、 烂床、 死苗的主要原因。 其最适发病温度为 25℃， 病菌多从伤口侵入。 一般地势低洼、 阴湿、 土质粘重的地方发病较严重， 可通过轮作倒茬、 培育无病壮苗、 药剂处理种薯等方法来进行防治。
甘薯根腐病多发生在北方薯区， 但近年来有向长江流域以南传播的趋势， 给甘薯生产造成极大危害[2]. 该病害为典型土传病害，带菌种苗是远距离传播的重要途径， 发病最适温度为 27℃左右， 连作地、沙土地及土壤含水量在 10%以下的地带易诱发此病，且发病较严重[3-5]. 可通过培育抗病品种 \ 辅助轮作换茬、适时早栽等农业措施来加以防治。
甘薯茎线虫病又叫空心病， 是国内植物检疫对象之一，其主要危害甘薯块根、茎蔓及秧苗，块根症状分糠心型、糠皮型和混合型 3 种；茎部症状多出现在髓部，起初为白色，后变为褐色干腐状；秧苗根部受害，在表皮上生有褐色晕斑，秧苗会发育不良、植株矮小发黄。 一般丘陵旱地、沙质壤土、连作地等发病严重。 可通过选育抗病品种、加强检疫、合理用药等方法来进行防治。
甘薯瘟病又名甘薯细菌性萎蔫病， 是一种毁灭性病害，也是我国的检疫对象之一，其在甘薯各生育期均可发病，表现的症状却不一样。 该病菌主要破坏组织的维管束，使水分和营养物质无法正常运输，其发病最适温度为 27℃~35℃。 病苗、病薯、带菌土、肥料和流水等均可传播。 可通过严格检疫、合理轮作、选用抗病品种等方法来进行防治。
甘薯蔓割病又名甘薯枯萎病、茎枯病等，为土传性病害。 该病在茎蔓、薯块上均能发病，病菌从伤口侵入，沿导管蔓延，病株叶片自下而上发黄脱落，最后全蔓枯死。 该病害发生适宜温度 27℃~30℃。 可通过选育抗病品种，结合轮作换茬、拔除病株等农业措施来防治。
甘薯蚁象主要分布在长江以南地区，目前已列为国内检疫对象之一。成虫和幼虫嗜食薯块，造成伤口，病菌同时感染造成腐烂。 该虫一年多代且世代重叠，防治起来较困难。 目前采用的防治方法主要有：消灭虫源、水旱轮作、及时培土、药液浸苗、毒饵诱杀等。
2 甘薯抗病基因的克隆、分析
2.1 植物抗病基因的分类
自 1992 年克隆到第一个植物抗病基因 HmⅠ以来，目前已分离获得 40 多个抗病基因，虽然这些抗病基因来自不同的作物、针对不同的病害，但它们编码的蛋白产物在结构上有很多的相似性， 如它们的蛋白产物含有核苷酸结合位点（NBS）、富亮氨酸重复（LRR）、跨膜结构域 （TM）、TolI-白介素-l 区域 （TIR）等一些相同的结构域[6]. 最终将植物抗病基因大致分为 6 类， 分别为：NBS-LRR 类、LRR-TM 类、LRR-TM-激酶类、Ser-Thr 激酶类、灭活毒素类功能酶及其他类[7].
2.1.1 NBS -LRR （nucleotide binding site plusleucine-rich repeat）类 NBS-LRR,即 核苷酸结合位点与富含亮氨酸的保守序列构成的蛋白产物， 该类是目前已知的抗病基因中存在最为广泛的， 目前已被成功克隆出的植物抗病基因中的大部分均属于该类， 其基本可分为 3 个小类：LZ-NBS-LRR 类、TIR-NBS-LRR 类和 NBS-LRR 类基因[8].
2.1.2 LRR-TM 类 LRR-TM 类，即胞外亮氨酸富集重复跨膜受体蛋白。 该类基因所编码的蛋白多为糖蛋白受体， 可锚定在细胞膜上。 这类蛋白一般由3 个部分组成，即：胞外 LRR 结构域、跨膜区域及一个较小的胞内区域[9].
2.1.3 LRR-TM-激酶类 LRR-TM-激酶类， 即指胞外亮氨酸富集重复跨膜受体激酶类。 在其产物中，既含有胞外 LRR 跨膜螺旋结构受体结构域， 又含有胞内的蛋白激酶结构域[10]. 这两个结构域之间还存在一个跨膜区， 从水稻基因组中克隆出的抗白叶枯病基因即属于该类。
2.1.4 Ser-Thr 激酶类 Ser-Thr 激酶类， 即丝氨酸/苏氨酸激酶类。 其特点为产物是丝氨酸和苏氨酸激酶，并不具有 LRR 结构域[11]. 这类基因需要对丝氨酸/苏氨酸旳残基进行磷酸化处理后才可以进行抗性反应[12]. 典型的例子是番茄的 Pto,Fen,Lr10 等基因。
2.1.5 灭 活毒素类功 能 酶 灭活毒素类功能酶 ,又称毒素还原酶类抗病基因， 该类基因产物是一类还原酶，该类还原酶能辅助还原型辅酶 II （NADPH）发挥作用，从而导致病原微生物所产生的毒素失活，以达到抗病的目的。 人类最早克隆出的植物抗病基因玉米 HmⅠ就属于该类。
2.1.6 其他类 除以上几种常见类型外， 植物抗病基因还有其他的存在形式，如大麦抗白粉病基因 Mlo并不属于上述几类， 也没有与上述几种类型抗病基因相类似的结构与产物， 但却能对大麦白粉病菌产生抗性，保护植株不受侵害[13],而这种形式的抗性反应在水稻等作物中也同样存在[14],有人将其归属于调控因子类。
2.2 抗病基因的克隆、分析
王钰[15]克隆了甘薯抗病基因的同源序列（RGA），结果发现克隆所得到的 342 个不同的甘薯 RGAs 与已知的抗病基因 L6、N、RGC1 等具有高度同源性，并利用 Cluxtalw 软件将其分为 22 个不同的类群。 在342 个 甘薯 RGAs 中 , 除 7 个 是 TIR 外 , 其 余属于non-TIR 类 型 , 这 2 个 类型是在 NBS-LRR 类 型的RGA 中 根据 TIR 的 有无而划分产生的 , 即 TIR -NBS-LRR 和 NO-TIRNBS-LRR 两类 RGA （简称 TIR和 non-TIR）。目前 TIR 仅在双子叶植物中被发现，如拟南芥的 RPM1 及 RPS2;non-TIR 在单、双子叶植物中均被发现存在[16-17].
陈观水[18]从抗根结线虫病甘薯品种青农 2 号和近缘野生种三浅裂野牵牛基因组 DNA 扩增出 28 条RGAs（其中甘薯 22 条，三浅裂野牵牛 6 条），序列分析表明，28 条 RGAs 编码的氨基酸绝大部分含有 P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a 等保守性结构域和疏水结构域（HD），而这些是典型的 NBS-LRR 类抗病基因所拥有的，其中部分还与马铃薯 Grol-4 基因、番茄 Mi-1、Mi-2、Hero、拟南芥 RPM1 等植物 R 基因具有很高的相似性，说明这些 RGAs 有可能为甘薯抗病基因部分片段。 并且初步认为甘薯 SPR1 基因为 non TIR-NBS-LRR 类抗病相关基因。
SGT1 是 近年来发现的一种植物抗病调控相关基因，其功能是能够调控着丝粒的装配，并调节泛素对目标靴蛋白的修饰[19],随后在很多植物和动物中均发现了该基因[20]. 很多研究表明，SGT1 基因与多种植物的抗病反应相关，目前为止在拟南芥、烟草、水稻、小麦和大麦等农作物中均已发现 SGT1 基因的存在。柏洁[21]以甘薯 RNA 为模板，成功获得了甘薯 SGT1 基因的全长序列信息，且该基因在甘薯的根、茎、叶中均有表达，未表现出明显的组织特异性。
3 甘薯抗病育种后续展望
目前采用常规育种方法选育甘薯抗病品种存在周期长、效率低等缺点，而将生物技术与常规育种方法相结合是培育抗病品种最有效的途径。 因为甘薯基因组的复杂性， 目前对其抗性基因方面的研究较少，今后可利用已知抗病基因保守结构域的特性，设计简并引物来获得甘薯抗病基因同源序列 RGAs,而这些 RGAs 可作为候补抗性基因来定位、克隆抗病基因，它同样也可应用于分子标记辅助选择育种。
但 RGA 技术的应用也存在一些问题和局限性，如 R 基因具有多个保守区域，利用不同保守区域设计引物所得到的 RGA 产物不同，因此保守区域的选择显得尤为重要，一般来讲 LRR 和 NBS 结构域的保守性较强，目前大多应用此保守结构域来设计引物，但有些非抗性基因同样具有 NBS、LRR 和丝氨酸/苏氨酸激酶等保守结构域，因此克隆出的 RGAs 未必都与R 基因有关。对 RGA 而言，它在基因组中以多拷贝形式存在，而且是呈簇状分布，很难将它们有效分开，这给克隆和定位 R 基因带来困难[6]. 针对这些问题，今后可利用从亲缘关系较近的植物中扩增出的 RGA为探针进行盯 RFLP 作图； 根据 RGA 序列设计特异性引物将其转换为 CAPS 标记，用于选择抗病品种以及将 R 基因通过基因渐渗的方式导入性状优良的品种中等措施来进行改善[22-23].
参考文献
[1]谢逸萍，孙厚俊，等。中国各大薯区甘薯病虫害分布及危害程度研究[J]. 江西农业学报，2009, 21（8）：121 -122.
[2]李鹏，马代夫，等。甘薯根腐病的研究现状和展望[J].江苏农业科学，2009（1）：114-116.
[3]江苏省农业科学院，山东省农业科学院。中国甘薯栽培学[M].上海：上海科学技术出版社， 1984.
[4]邬景禹，郭小丁，方树民，等。甘薯根腐病的认识及防治措施[J].福建农业科技，1993（2）：30.
[5]闫加启，李淑英。甘薯根腐病的发生与防治[J].北 京农业，2006（12）：41.