生物医学工程中金属纳米簇的运用

　　摘    要：　金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料, 展现出良好的生物相容性和优良的物化性质, 近年来受到各个领域的关注, 尤其在生物医学领域得到了广泛的应用。该文在介绍多种金属纳米簇的合成方法和光学性质的基础上, 综述了金属纳米簇在生物传感、生物成像和肿瘤治疗等领域的应用研究进展, 并对其面临的挑战和应用前景进行了展望。

　　关键词：　金属纳米簇; 生物医学应用; 生物传感; 生物成像; 肿瘤治疗;
 

　　Abstract：　Fluorescent metal nanoclusters (MNCs) , as novel fluorescent materials, exhibit good biocompatibility and excellent physicochemical properties, which have attracted more and more attention in various fields, especially in the biomedical field. In this review, the synthesis methods and optical properties of various metal nanoclusters are described. Then, the applications of metal nanoclusters in the biomedical field are reviewed from three aspects of biosensing, bioimaging and cancer therapy. Finally, the future challenges and application prospects of the MNCs in biomedical application are discussed.

　　Keyword：　metal nanoclusters; biomedical application; biosensing; bioimaging; cancer therapy;

　　荧光金属纳米簇 (Metal nanoclusters) 是一类由几个至数百个金属原子堆积而成的纳米材料, 处于单个金属原子和较大的金属纳米颗粒之间的过渡状态[1]。金属纳米簇的尺寸接近费米波长 (<2 nm) , 与较大的纳米颗粒相比, 具有更为独特的物理化学性质, 因而表现出优异的光学特性, 如荧光发射可调、斯托克斯位移大、荧光稳定性高、量子产率较高等[2,3]]。荧光金属纳米簇的合成一般采用模板法, 以生物分子 (蛋白质、DNA、氨基酸和多肽等) 作为合成的配体, 金属离子在还原剂的作用下被还原成原子团簇。与传统的荧光染料和量子点相比, 荧光金属纳米簇的毒性大大降低, 生物相容性显着提高。因此, 它们作为一种新型的纳米荧光探针, 在生化分析、环境检测、医学成像和肿瘤治疗等领域得到了广泛应用[4,5,6,7,8]]。

　　目前, 有关金属纳米簇的综述已有不少报道[9,10,11,12,13], 但大多侧重于金属纳米簇的生化应用研究进展, 或仅围绕一种金属纳米簇展开论述。本文将对各种金属纳米簇的合成与性质进行概述, 进而对其在生物医学领域包括生物传感、生物成像及肿瘤治疗中的应用进行阐述, 并对金属纳米簇在生物医学领域面临的挑战和发展机遇进行了探讨。

　　1、 荧光金属纳米簇的合成

　　荧光金属纳米簇的合成根据路径可分为“自下而上”和“自上而下”两种方法, 如图1所示[14]。前者使金属离子 (Mn+) 在还原剂存在下被还原为零价金属 (M) , 零价金属再在配体分子上成核生长为纳米簇。目前常用的配体分子有脱氧核酸 (DNA) 、多肽、蛋白质、巯基小分子或聚合物等。“自上而下”法是通过配体对大尺寸纳米粒子的刻蚀作用进而获得小尺寸的纳米簇, 按还原方法不同又可分为化学还原法、光还原法、超声还原法、微波还原法和电化学还原法等。为获得性质优良的金属纳米簇, 上述方法通常需考虑以下因素: (1) 配体与金属原子间较强的相互作用力; (2) 适宜的还原条件; (3) 足够的老化时间。以下针对不同金属纳米簇的特点, 分别对其常用的合成方法进行了介绍。

　　图1 金属纳米簇的不同制备方法[14]Fig.1 Various routes for the synthesis of metal nanoclusters[14]

　　1.1、 荧光金纳米簇的合成

　　荧光金纳米簇 (Au NCs) 是金属纳米簇中稳定性最好的纳米材料之一, 相关研究开展最早。通常利用HAuCl4作为金属前驱体, 由于Au原子与S原子之间存在较强的共价结合力, 因此一般选择含巯基的生物分子作为配体, 在适当的还原条件下一步合成具有荧光发射的Au NCs[15,16,17]]。该方法一方面利于簇的形成, 获得光学性质优良的Au NCs;另一方面可降低材料的毒性, 使Au NCs具有良好的生物学应用价值。Negishi等[18]]利用谷胱甘肽 (GSH) 作为配体, 在NaBH4还原下合成了含不同Au原子个数的Au NCs, 结果表明其光学性质普遍具有配体浓度和金核原子个数依赖性;Xie等[19]利用牛血清蛋白 (BSA) 为配体和还原剂发展了一种“绿色”方法制备了量子产率为6%的Au NCs, 它在一定激发光照射下发出红色荧光 (图2) 。采用相似的化学还原方法, 以胃蛋白酶[20]、乳铁蛋白[21]、胰蛋白酶[22]、溶菌酶[23]和木瓜蛋白酶[24]等蛋白质为配体的Au NCs也相继被合成。另外, 还可通过“自上而下”法即利用含巯基的配体对尺寸较大的金纳米颗粒 (Au NPs) 进行刻蚀作用合成Au NCs。刻蚀途径分为配体诱导的刻蚀和对金属核的直接刻蚀两种途径。前者是利用过量的配体对Au NPs表面的Au原子进行“剥离”, 形成配体-Au+复合物, 复合物之间再通过亲金作用 (Au+-Au+) 相互结合形成Au NCs[25]5];后者是利用过量配体对Au NPs的金核直接进行刻蚀, 使其粒径逐渐减少, 形成具有荧光发射的Au NCs[26]6]。

　　图2 BSA-Au NCs的“绿色”合成方法[19]Fig.2 Green synthesis of BSA-Au NCs[19]

　　除了上述以Au—S的共价结合作用制备Au NCs外, 树枝状的大分子内部空腔中丰富的表面官能团也可以络合Au3+形成复合物用于Au NCs的制备。利用聚酰胺-胺型树枝状高分子 (PAMAM) 为配体, Bao等[27]]发展了两种制备Au NCs的方法:一种是在生理温度下缓慢合成具有绿色荧光发射的Au NCs;另一种是以抗坏血酸为还原剂, 通过缓慢还原Au3+合成具有多种荧光发射的Au NCs。为缩短合成时间, Jao等[28]]发展了微波还原法用于PAMAM-Au NCs的快速合成, 合成时间由4 d缩短至0.5 h;Liu等[29]]利用超声还原法制备了近红外发射的BSA-Au NCs;Zhang等[30]]利用光还原法制备了以巯基化的聚合物为配体的Au NCs。这3种物理还原方法均不需其他还原剂的参与, 制备过程简易并提高了量子产率。研究表明, Au还能与含氮碱基腺嘌呤和胞嘧啶相互作用而结合[31]], 因此DNA也能作为配体合成Au NCs[32,33]]。

　　1.2、 荧光银纳米簇的合成

　　与金纳米簇类似, Ag原子与S原子之间也存在较强的共价结合力。因此, 含巯基的化合物亦可作为配体合成银纳米簇 (Ag NCs) 。Adhikari等[34]以二氢硫辛酸 (DPA) 为配体, 利用NaBH4还原Ag+, 合成了具有近红外荧光发射的Ag NCs, 该Ag NCs的斯托克斯位移大于200 nm, 具有应用于细胞成像的潜力。在此基础上, Yuan等[35]]发展了以巯基化合物为配体的反向转移法, 即在水相中经化学还原后, 再将体系转移至乙醇中进行缓慢刻蚀, 所合成的Ag NCs具有更好的分散性, 超高的稳定性和超小的尺寸。Zhu等[36]]用该方法合成了具有蓝色和红色双发射荧光的GSH-Ag NCs, 合成过程中GSH和Ag+的浓度比值发生改变, 双发射峰的荧光强度也随之改变。

　　PAMAM等聚合物由于带大量的官能团也可作为合成Ag NCs的一类配体。Zheng等[37]在该方面做了开创性的研究, 首次以羟基封端的PAMAM为配体合成了稳定的Ag NCs。Yuan等[38]以超支化聚乙烯亚胺 (hPEI) 为配体, 抗坏血酸为还原剂合成了蓝绿色荧光发射的hPEI-Ag NCs, 该纳米簇具有很好的pH值稳定性, 可用于Cu2+的检测。

　　2004年, Petty等[39]首次以单链DNA为模板, 在NaBH4还原下合成了具有荧光性质的Ag NCs, 且证明了Ag+和胞嘧啶之间具有强烈结合力。此后, Ritchie等[40]]发现Ag NCs的发射波长与DNA上Ag+的还原状态有关, 完全还原与非完全还原的Ag NCs表现出不同的发射波长, 不同程度的非完全还原Ag NCs的发射波长也不同。由于Ag+与4种碱基 (A, T, C, G) 的亲和力不同, 可通过改变DNA的序列调节Ag NCs的荧光性质。Richards等[41]]利用基因芯片技术优化出5条单链DNA序列, 可用于合成不同荧光发射的Ag NCs, 其发射波长从可见区到近红外区。此外, 双链DNA也可用于Ag NCs的合成。Guo等[42]]发现在双链DNA上外加1个胞嘧啶小环, 并以此为模板合成的Ag NCs具有较强的模板依赖性。随后, Ma等[43]]发现双链DNA的错配碱基位点可以特异性生长银簇。Gwinn等[44]]发现Ag NCs的光学性质还可通过DNA的二级结构调控, 并首次以发卡DNA为模板, 通过调节环部胞嘧啶的数目合成了4种Ag NCs。

　　1.3、 荧光铜纳米簇的合成

　　相比于贵金属纳米簇Au NCs与Ag NCs, 有关铜纳米簇 (Cu NCs) 的报道相对较少, 主要是由于Cu NCs更易被氧化且制备过程中尺寸难以控制。硫醇类化合物中的巯基与Cu2+之间能形成Cu—S共价键, 因此硫醇类化合物也能作为合成Cu NCs的配体。Wei等[45]]利用2-巯基-5-丙烷基嘧啶为配体, 在NaBH4还原下合成了具有双发射的Cu NCs, 在氧气的电还原反应中表现出很高的电催化活性。由于某些聚合物在水溶液中能与Cu2+螯合, Zhao等[46]6]以含有叔胺的羟基封端的PAMAM为配体, 利用叔胺与Cu2+的络合作用, 在NaBH4的还原下成功合成了Cu NCs。多肽和蛋白质等生物大分子也能作为配体为Cu2+提供结合位点, Huang等[47]47]以多肽作为配体, 在抗坏血酸的还原下制备了量子产率为7.3%的Cu NCs, 其荧光具有温度敏感性。Wang等[48]48]以BSA为配体, 在水合肼的还原下制备了发射红色荧光的Cu NCs, 其荧光具有pH值响应性, 可应用于细胞成像。

　　DNA分子中富含各种官能基团, 如杂环氮、氨基、磷酸基等, 能与不同的金属离子结合, 因而可用于各种金属纳米簇的合成。Rotaru等[49]首次以双链DNA为模板合成了具有荧光性质的Cu NCs, 发现通过控制双链DNA的长度可以调节Cu NCs的尺寸和荧光 (图3A) 。随后, 本课题组[50]系统地筛选了能够作为配体分子稳定合成Cu NCs的单链DNA, 研究结果表明, 在还原剂抗坏血酸钠的存在下, 只有聚胸腺嘧啶寡核苷酸Poly (thymine) 能够快速有效地稳定合成荧光Cu NCs (图3B) 。

　　图3 双链DNA (A) [49]和单链DNA (B) [50]介导合成荧光铜纳米簇 (Cu NCs) 示意图Fig.3 Schematic illustration of fluorescent Cu NCs templated by double-stranded DNA (A) [49]and single-stranded DNA (B) [50]

　　1.4、 其他金属纳米簇的合成

　　除上述3种常见的金属纳米簇外, 一些荧光金属纳米簇也被相继合成。例如, Kawasaki等[51]将H2PtCl6加入N, N-二甲酰胺 (DMF) 溶液中, 在140℃下油浴8 h, 利用DMF的还原能力首次合成了铂纳米簇 (Pt NCs) ;Hyotanishi等[52]]以PdCl2为金属前驱体采用相同方法合成了钯纳米簇 (Pd NCs) ;Tanaka等[53]3]以巯基乙酸为配体合成了蓝光发射的Pt5NCs, 其量子产率达18%;以树枝状大分子[54]54]、GSH[55]55]等为配体制备的Pt NCs也相继被报道。此外, 为得到性质更优良的金属纳米簇, 通过掺杂或偶联的双金属或多金属纳米簇也被逐渐发展。它们一般以单金属纳米簇的制备方法为基础, 发展简单的一步法或二步法进行合成, 如Su等[56]56]以DNA为配体, 加入前驱体Cu (NO3) 2和AgNO3, 在NaBH4还原下一步合成了DNA-Cu/Ag NCs, 该纳米簇的量子产率高达47%;依据此方法随后又合成了DNA-Au/Ag NCs[57]。以BSA-Au NCs的合成方法为基础, 还合成了具有双发射的BSA-Ce/Au NCs[58]。Zhang等[59]利用微波还原法快速简便地制备了GSH-Au/Ag NCs, 其量子产率相对于GSH-Au NCs也明显提高。

　　2、 金属纳米簇的光学性质

　　1961年, Kubo等[60]提出了着名的久保理论和纳米粒子所具有的独特的量子限域效应。进一步研究表明, 当金属粒子粒径不断减小时, 能级间隔逐渐增大, 当减小至与电子的费米波长相当时, 电子能级由连续能级分裂成分立能级 (图4) [61]。因此, 1~2 nm的金属纳米簇并不具备表面等离子共振 (SPR) 吸收性质, 但在一定波长的光作用下, 金属纳米簇可实现能级之间的电子跃迁, 从而表现出一定的光吸收和从可见到近红外光区域的荧光发射性质。金属纳米簇产生荧光的主要机理有两种:与固有的量子尺寸效应相关的金属内核;由金属核与表面配体间相互作用控制的纳米簇表面[62]。此外, 结构、表面配体、氧化状态、温度、pH值、离子强度等因素也会影响金属纳米簇的光学性质, 其中表面配体的给电子能力是决定金属纳米簇量子产率的重要因素, 配体给电子的能力越强, 金属纳米簇的荧光越强。所以通过增加配体的给电子能力、增加金属核所带正电荷和使用富含给电子的原子或基团的配体可在一定程度上提高金属纳米簇的量子产率。

　　图4 尺寸对金属材料的能级结构影响[61]Fig.4 Effect of size on metal materials structure[61]

　　近年来, 金属纳米簇的电化学发光 (ECL) 性质不断被开发和利用。金属纳米簇的ECL是电化学反应和化学反应的结合, 通常具有荧光性质的金属纳米簇均有电化学发光特性, 但两者发光的原理不同, 电化学发光是自由基离子在外加电压的激发下产生于电极表面, 继而形成激发态, 当激发态向基态能级跃迁时伴随光子产生, 因而在基于金属纳米簇的ECL体系中, 往往表现出更强的信号。

　　3、 金属纳米簇在生物医学中的应用研究

　　荧光金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料, 相较于传统的荧光染料和量子点, 具有易制备、易修饰、尺寸超小、斯托克斯位移大、生物相容性良好, 以及荧光光谱可调等优势, 在生化分析、环境检测、医学成像和肿瘤治疗方面具有广泛的应用。

　　3.1、 金属纳米簇在生物传感中的应用

　　金属离子广泛存在于生物体中, 参与生物体内各种复杂的生化过程, 以维持生命体系的一切正常活动, 但许多金属离子 (如Cu2+、Fe3+等) 超过一定浓度时均具有毒性作用。基于金属纳米簇较高的物化活性, 目前已构建了多种简便的传感平台用于金属离子的高灵敏检测[63,64]。其中Cu2+的检测大多是基于Cu2+对荧光猝灭的原理, 如Yuan等[65]利用hPEI合成了高稳定的Ag NCs, Cu2+通过结合hPEI的氨基形成铜氨络合物, 与Ag NCs发生能量转移导致荧光猝灭, 将该材料包埋于水凝胶中, 进而发展了一种Cu2+的可视化检测方法, 检出限达10 nmol/L。但荧光猝灭型传感器易受外界环境的干扰, 产生“假阳性”信号, Lan等[66]针对这一缺陷发展了基于DNA-Ag NCs的荧光增强型Cu2+传感器, Cu2+加入DNA-Ag NCs后形成了结构紧密、荧光更强的DNA-Cu/Ag NCs, 该方法具有很好的选择性, 检出限为8 nmol/L。为提高Cu2+检测的灵敏度, Yan等[67]合成了组氨酸 (His) 稳定的Au NCs, 并首次利用其过氧化物酶活性实现了Cu2+的比色检测, His-Au NCs在H2O2的存在下可催化四甲基联苯胺 (TMB) 发生显色反应, Cu2+加入后与His的氨基、羧基及咪唑环结合会抑制该Au NCs的酶活性, 该方法的线性范围为1~100 nmol/L, 检出限可达0.1 nmol/L。近年来, 利用金属纳米簇还实现了血清和活细胞中Fe3+的分析检测, Feng等[68]利用hPEI为配体合成了Fe3+响应的Cu NCs, 并实现了在血清等复杂样品中对Fe3+的灵敏检测;Huang等[69]发现以硫辛酸为配体合成的Au/Ag NCs对Fe3+具有较好的响应, 基于团聚导致荧光猝灭原理构建了Fe3+荧光传感方法并成功应用于活细胞成像。此外, 金属纳米簇也被应用于其他离子如Ag+、As3+、Cd2+、Cr3+、Cr6+、Hg2+和Pb2+[3,11,70,71]等的检测。

　　生物分子作为生物体特有的物质, 其含量水平与生命活动息息相关。其中生物巯基分子 (GSH) 、半胱氨酸 (Cys) 和同型半胱氨酸 (Hcy) 是许多多肽和蛋白质的重要组成部分, 在细胞的氧化还原平衡、癌症的发生发展中发挥着重要作用, 且三者之间紧密联系。Huang等[72]构建了基于DNA-Ag NCs的荧光增强型传感器用于生物巯基化合物的检测, 由于DNA-Ag NCs具有很强的DNA序列及DNA结构依赖性, 通过优化合成Ag NCs的DNA序列, 得到了具有GSH、Cys和Hcy响应的荧光探针。Xu等[73]以巯基十一酸和甲硫氨酸为配体一步法合成了橘黄色发射的Au NCs, 利用Au NCs和GSH竞争性结合Cu2+诱导荧光变化而实现了GSH的检测, 检出限为9.7 nmol/L, 并成功应用于活细胞内GSH的监测。Zhang等[74]利用聚胸腺嘧啶寡核苷酸 (Poly (thymine) ) 为模板合成的Cu NCs构建了一种免标的纳米传感器, 结合Thymine-Hg2+-Thymine的作用机制, 实现了对GSH、Cys和Hcy的快速检测。三磷酸腺苷 (ATP) 作为生物体新陈代谢的能量物质, 其能量和消耗速率与许多疾病的发生有关, Zhang等[75]]首次发现相邻的DNA-Ag NCs与G四聚体/氯化血红素 (Hemin) 复合物之间存在的光致电子转移现象 (PET) 可用于ATP的特异性检测, 设计了含ATP的核酸适配体 (Aptamer) 、富G序列及Ag NCs模板序列的DNA序列。当ATP和Hemin存在时, Aptamer构象发生改变, G四聚体/Hemin随之形成, 并与DNA-Ag NCs产生PET效应导致荧光猝灭, ATP的检出限为8 nmol/L。除了荧光猝灭型传感器, Xu等[76]]和Zhou等[77]]发展了基于DNA-Ag NCs和DNA-CuNCs的荧光增强型探针用于ATP的检测。此外, 荧光金属纳米簇还被广泛应用于生物大分子核酸和蛋白质的检测, 核酸的定量检测有利于对生理状态进行实时监测, 并对临床诊断起到很好的指导作用。Liu等[78]]构建了DNA-Ag NCs/氧化石墨烯 (GO) 体系, 利用GO可以吸附单链DNA并猝灭荧光的原理, 通过设计DNA序列实现了多种目标物的检测, 包括乙型病毒 (HBV) 等病原DNA以及ATP、凝血酶等生物分子。Miao等[79]]建立了一种基于DNA-Ag NCs和金纳米颗粒荧光猝灭作用的miRNA检测方法, 通过对DNA-Ag NCs的DNA进行功能化, 即设计其中一端用于合成Ag NCs, 另一端与miRNA互补用于捕获靶标和吸附带正电的Au NPs以猝灭Ag NCs的荧光, 在双联特异性核酸酶 (DSN酶) 的作用下, DNA/RNA杂交链中的DNA链被水解, Ag NCs远离Au NPs表面, 荧光得到恢复, 该方法的miRNA检出限为33.4 fmol/L。目前, 以不同的金属纳米簇为敏感探针构建的化学传感平台也被应用于可卡因[80]]、H2O2[81]]、活性氧 (ROS) [82]]等的检测。

　　pH值和温度是生物体内最基本的生理参数, 它们调控着大多数细胞内生物分子的活性, 对于衡量生命活动正常与否至关重要, 监测细胞内的pH值和温度对分析细胞行为和疾病诊断及治疗有重要意义[83,84]。Chen等[58]利用一步法合成的双发射BSA-Ce/Au NCs作为pH值敏感探针, 构建了一种比率型pH传感器, 在pH 6.0~9.0范围内, 该探针的荧光信号比率I410/I650与pH值存在良好的线性关系, 且具有良好的稳定性和生物相容性, 已成功应用于HeLa细胞内的pH值监测。近年来发现Cu NCs也可作为pH值指示材料, Zhang等[85]]利用丝蛋白为配体合成了具有蓝光发射的Cu NCs, 在一定范围内, 其荧光信号与pH值变化成正比。Wu等[86]]将pH值敏感的异硫氰酸荧光素 (FITC) 染料交联到BSA-Au NCs表面, 发展了一种可用于pH值和温度传感的荧光探针, 并实现了对活细胞内pH值和温度的监测。Zhou等[87]]报道了一种双荧光DNA-Ag NCs探针用于温度传感, 该探针由两条含Ag NCs单链DNA通过碱基互补配对杂交组成, 传感机制是基于温度的升高导致两条DNA逐渐解链, 从而使银簇对分开, 荧光随之发生变化。除了利用金属纳米簇的荧光强度作为信号对温度进行传感外, Shang等[88]]还利用Au NCs的荧光寿命作为信号实现了活细胞内的温度传感。

　　3.2、 金属纳米簇在生物成像中的应用

　　除了在生物传感中的应用, 许多金属纳米簇也被应用于生物成像领域, 尤其是以蛋白质、多肽等生物内源性分子为配体合成的金属纳米簇, 它们往往具有生物相容性好、易功能化修饰的特点, 在生物成像应用中表现出独特的优越性。Wang等[89]以GSH-Ag NCs前体为配体, 利用电化学还原法合成了具有红光发射的Au NCs, 量子产率为10%, 该Au NCs在癌细胞和正常细胞的成像中均表现出良好的稳定性和生物相容性。由于癌细胞中GSH的浓度远高于正常细胞的浓度[90], Chen等[91]将此特性应用于Pt NCs在癌细胞内的原位合成并实现了细胞成像 (图5A) 。此外, 金属纳米簇通过表面功能化后用于靶向肿瘤细胞的成像研究也相继报道, 叶酸[92]、TAT肽段[93]、RGD肽段[94]、Aptamer[95]等生物分子的靶向功能化修饰在生物成像中发挥着越来越重要的作用。为避免细胞成像时的自发荧光和背景荧光的干扰, 许多研究者基于材料的特性引入了双光子成像技术并得到了更深层次的细胞成像效果。Shang等[96]发展了新型的DPA-Au NCs, 利用双光子成像技术实现了对HeLa细胞横截面的3D成像。随后, 功能化的BSA-Au NCs[97,98]利用双光子成像技术在肿瘤细胞中也得到了应用。此外, 荧光寿命成像技术也能弱化成像时生物组织自发荧光和背景荧光的缺点, Shang等[88]以硫辛酸-Au NCs作为荧光探针, 利用其荧光寿命的温度敏感性, 发展了一种活细胞中温度响应的荧光寿命成像方法 (FLIM) , 在生理温度范围内, Au NCs的荧光寿命变化范围为970~670 ns (图5B) 。利用Ag NCs对细胞进行荧光寿命成像的研究也早有报道[99]。

　　除了上述利用金属纳米簇荧光性质进行单一模式的细胞成像, 多模式的成像技术在细胞及活体层面也得到了发展和应用。Wang等[100]采用声波还原法合成了GSH-Cu NCs, 利用该Cu NCs近红外荧光发射和顺磁性质的特性, 将近红外荧光 (NIRF) /核磁共振 (MRI) 双模式成像技术成功应用于HeLa细胞内。目前, 基于镧系元素离子Gd3+的造影剂广泛应用于肿瘤的成像, Hou等[101]]发展了由Gd3+介导Au NCs自组装形成的纳米颗粒 (GNCNs) 用于癌症多模式成像的方法, Gd3+的加入使复合纳米颗粒的荧光大大增强, 利用该材料实现了在A549细胞和活体内的NIRF/CT/MRI多模式成像。

　　3.3、 金属纳米簇在肿瘤治疗中的应用

　　基因治疗在肿瘤治疗中表现出良好的应用前景, 其面临的挑战之一是需引入安全、靶向、高效的载体系统。金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料, 具有生物相容性好、稳定性高、易于合成与修饰等 (基因治疗载体系统所必需的) 诸多优点, 可在一定程度上提高该治疗模式的应用价值。Tao等[102]合成了聚乙烯亚胺 (PEI) -Au NCs, 利用PEI的“质子海绵效应”, 将PEI-Au NCs作为一种安全有效的基因载体实现了HepG2中pDNA的高效转运与转染。高分子量的PEI具有高效的转染效率, 而Au NCs在很大程度上降低了高分子量PEI的毒性, 因此PEI-Au NCs在基因治疗中表现出很好的应用前景。基于类似原理, Wang等[103]]发现PEI-Cu NCs也可作为载体且表现出基因转运的潜力。Vankayala等[104]]利用细胞核定位肽 (TAT) 对Au NCs进行靶向功能化, Au NCs的荧光和核染料在细胞中实现了共定位, 结果表明TAT-Au NCs在HeLa细胞和斑马鱼中的转染效率达81%, 是常用脂质体载体的3.2倍。Dutta等[105]]将自杀基因整合到pDNA内, 然后通过静电作用吸附到BSA-AuAg NCs上, 根据AuAg NCs的荧光信号可对基因转运进行成像, Caspase 3活性检测表明该基因治疗体系对肿瘤细胞起到了较好的凋亡作用。Lei等[106]]发现GSH-Au NCs结合神经生长因子NGF的siRNA (GNC-siRNA) 可使NGF基因沉默并提高胰腺癌治疗效率, GNC-siRNA复合物增加了siRNA在血清中的稳定性, 延长了siRNA在血液中的循环寿命, 增强了siRNA的细胞摄取和肿瘤积累。另外, 将功能化的Ag NCs作为载体转运siRNA也有报道[107]7]。

　　随着生物纳米材料的发展及其向医学领域的不断渗透, 荧光纳米材料和肿瘤化学治疗相结合逐渐成为当前攻克肿瘤研究的重要手段, 其中金属纳米簇所具有的光学性质和生物相容性使其在该领域中表现出良好的应用前景。Khandelia等[98]构建了一种装载Au NCs和阿霉素 (Dox) 的纳米诊疗复合粒子, 该复合粒子既可对癌细胞进行双光子成像, 又可对癌细胞达到化学治疗的作用。Chen等[108]对Au NCs@His进行癌细胞内外的双靶向修饰和药物交联, 发展了基于Au NCs-Dox-cRGD-Aptamer的诊疗一体化纳米平台, 提高了药物对肿瘤组织的亲和力与渗透率, 实现了肿瘤部位的成像及药物的靶向递送。Zhou等[109]制备了BSA-Au NCs连接顺铂和叶酸的纳米药物复合物, 结果表明基于Au NCs的纳米平台在肿瘤的成像和治疗方面具备良好的发展前景。另外, Cu NCs也具有此方面的潜力, 如图6所示, Goswami等[110]直接以具有癌细胞靶向性的转铁蛋白 (Tf) 作为配体合成了Tf-Cu NCs, 并利用静电相互作用力装载Dox制备了Tf-Cu NCs-Dox NPs, Dox与Cu NCs之间存在荧光共振能力转移 (FRET) 效应, 当该靶向型纳米颗粒进入癌细胞后, Cu NCs的荧光随着Dox的释放而恢复, 利用FRET策略对肿瘤组织达到了诊疗一体化的目的。

　　肿瘤的物理治疗主要是利用光对癌变组织进行放疗及光动力学治疗。首先, X射线可以离子化DNA分子, 或与H2O作用生成活性氧物质, 其中·OH可诱导细胞DNA发生损伤达到治疗肿瘤的目的[111];另一方面, 高原子序数的金属元素在X射线诱导下发生生化反应, 反应产物与癌细胞内水分子反应生成自由基, 可使DNA发生电子转移而被氧化, 因此某些金属纳米簇有放疗增敏的作用[112]。Zhang等[113]在利用Au NCs作为放疗增敏剂提高肿瘤放疗效果的研究中做了先导性的工作, 研究结果表明超小尺寸的Au NCs可以避免网状内皮系统的吞噬, 有效提高肿瘤的放疗疗效。基于此, Liang等[114]采用c (RGDyC) 肽为配体, 结合其癌细胞靶向功能制备了具有肿瘤靶向及放疗增敏作用的Au NCs。基于金属纳米簇表面官能团与光敏剂交联可应用于肿瘤的光动力学治疗 (PDT) , Nair等[115]将原卟啉 (PPIX) 与叶酸修饰的硫辛酸-Au NCs共价交联, 利用该材料实现了活体中肿瘤部位的光动力学治疗的实时成像。PPIX还可与近红外发射的Aptamer (AS1411) -Ag NCs通过G四聚体相连, 基于此方法, Ai等[116]]构建了基于DNA-Ag NCs的诊疗一体化平台。研究表明, 在肿瘤细胞内会产生抗氧化防御机制以应对持久的PDT治疗, 例如过度表达硫环蛋白还原酶 (TrxR) 可以抵抗细胞内增加的ROS水平[117]], Gao等[118]]发现Au NCs能有效抑制肿瘤细胞内TrxR, 将Au NCs和光敏剂二氢卟吩e6 (Ce6) 同时负载到pH敏感性脂质体中, 在细胞内溶酶体酸性环境下, Au NCs和Ce6被快速释放到胞浆, 金簇有效抑制了胞浆内的TrxR, 使得细胞内产生的ROS不能被及时清除, 提高了Ce6介导的光动力学诱发的细胞内ROS水平, 改善了PDT的治疗效应。而且, 某些金属纳米簇可直接作为光敏剂用于光动力学治疗。Kawasaki等[119]]研究发现以苯乙硫醇或卡托普利为配体合成的Au NCs具有光敏剂特性, 在可见/近红外光激发下能够有效地产生单线态氧, 并基于以上独特的性质, 使用卡托普利-Au NCs作为生物相容性光敏剂实现了对癌细胞的光动力学治疗。Vankayala等[104]]利用TAT肽段对Au NCs进行靶向功能化, 以TAT-Au NCs作光敏剂实现了HeLa细胞的光动力学治疗。

　　图5 Pt NCs在癌细胞内的原位生物合成及荧光成像 (A) [91], 以及硫辛酸-Au NCs作为荧光探针在不同温度下对HeLa细胞进行荧光寿命成像 (B) [88]Fig.5 In situ biosynthesis of Pt NCs and cell imaging (A) [91], and FLIM images of HeLa cells with internalized Au NCs at different temperatures (B) [88]

　　图6与Tf-Cu NCs-Dox NPs孵育不同时间后HeLa细胞的荧光共焦显微镜图像 (A) , 及Tf-Cu NCs-Dox NPs对小鼠的肿瘤抑制能力监测 (B) [110]Fig.6 Fluorescence confocal microscopy images of HeLa cells at different time of treatment (A) , and experimentalscheme representing the effect of Tf-Cu NCs-Dox NPs in tumor bearing Swiss albino mice monitored for 50 days (B) [110]

　　4、 结论与展望

　　本文系统地介绍了不同金属纳米簇的合成方法和荧光性质, 并从生物传感、生物成像和肿瘤治疗三方面总结了近年来它们在生物医学领域的研究进展。荧光金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料, 不仅拥有良好的荧光性质, 还有更好的生物相容性。此外, 配体合成的荧光金属纳米簇通常还有易于修饰的特点, 从而可对其荧光性质、靶向识别等进行调整和优化。这些优良特性, 使金属纳米簇在生物医学领域展现出更多的应用潜能。

　　尽管金属纳米簇在生物医学领域已取得一定成果, 但进一步的发展还面临着严峻的挑战。首要解决的问题是如何制备纯度和量子产率更高的金属纳米簇。与量子点和有机染料相比, 目前所合成的金属纳米簇量子产率偏低, 实现金属纳米簇中金属核组分与尺寸可控合成、增加表面配体的给电子能力等是解决该问题的突破口。其次, 由于金属纳米簇本身具有较高的物化活性, 而在生物成像或治疗应用时往往需要更为准确且稳定的荧光信号, 因此如何在细胞或活体等复杂生物环境中提升该荧光材料的抗干扰能力是非常重要的。最后, 金属纳米簇的表面功能化对于其在生物医学领域的应用研究十分关键, 一方面, 金属纳米簇作为传感器、荧光染料、基因载体或药物载体等角色, 高效率的表面功能化修饰有利于其更好的发挥作用;另一方面, 功能化修饰会使金属纳米簇表面的化学基团发生变化, 从而导致材料本身的荧光性质发生变化。许多研究表明, 以荧光金属纳米簇为基础构建的生物标记、生物传感、生物成像以及靶向的肿瘤治疗平台具有十分广阔的前景, 但将其应用于临床实践尚需结合其他功能性材料进行更多深入、系统的研究。通过将金属纳米簇的优良性质与其他造影剂或治疗药物相结合, 有望实现多功能金属纳米复合材料的合成及多模态成像与治疗的应用, 为临床实践提供坚实的理论基础和技术支持。总之, 随着理论基础、合成技术以及各方面技术的综合发展, 荧光金属纳米簇将为生物医学领域的研究提供新的契机, 为细胞内传感、成像以及治疗开拓新的途径。

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