组蛋白修饰与基因调控、疾病的关系研究

　　表观遗传学是针对不涉及 DNA 序列变化而表现为 DNA甲基化谱、染色质结构状态和基因表达谱在细胞间传递的遗传现象的一门科学。目前表观遗传学通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了可遗传的改变，而 DNA 序列不发生改变.其机制主要包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码 RNA.目前已知核小体组蛋白蛋白质的共价翻译后修饰在基因调控中发挥着重要作用。常见的组蛋白尾部修饰方式有乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、小类泛素化（SUMO） 等。

　　1 组蛋白修饰与基因调控

　　组蛋白是碱性蛋白质，通常带正电荷，能与带负电荷的DNA 分子结合，从而遮蔽了 DNA 分子，妨碍了转录。乙酰化由组蛋白乙酰基转移酶（HAT） 催化，去乙酰化由组蛋白去乙酰基酶（HDAC） 催化。由于体内存在组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡关系，所以组蛋白乙酰化发生频率很低。HAT 催化的基本机制包括从乙酰辅酶 A 转让一个乙酰基到目标组蛋白赖氨酸侧链的 ε-氨基组。为了进行这样的转变，不同 HAT 采用其独特的战略。HATs 基于它们的亚细胞定位通常分为两个不同的类型。A 型 HATs 位于细胞核并通过染色质核小体组蛋白的乙酰化作用参与基因表达的调控。它们包含一个结构域，帮助他们识别和结合到组蛋白乙酰化的赖氨酸残基。Gcn5、p300/CBP和 TAFII250 是一些 A 型的 HATs,配合催化剂增强转录。B 型HATs 位于细胞质并负责核小体组装前合成新的乙酰化组蛋白。这些 HATs 缺乏一种结构域，因为他们的任务是识别新合成的尚未乙酰化的核心组织蛋白。乙酰基添加的 B 型 HATs到组蛋白一旦进入细胞核就会被 HDACs 清除并纳入染色质。

　　HDAC 催化了组蛋白的去乙酰化，它们通常与一些辅抑制因子形成大的转录抑制复合物。这些含 HDAC 的复合物，去除修饰组蛋白的 ε-N-乙酰赖氨酸乙酰基，暴露组蛋白尾端带正电荷的赖氨酸残基，而带正电荷的组蛋白尾部与 DNA 之间的相互作用限制了核小体在 DNA 上的移动，使启动子不易接近转录调控元件，从而导致基因特异性的转录抑制.通常，组蛋白高乙酰化是基因转录激活的一个标志，在转录活性区域组蛋白被乙酰化，使与之相结合的基因处于转录激活的状态，而去乙酰化的组蛋白与转录受抑制的基因区域结合，因此其过程是一个与基因活性诱导和抑制密切相关的动态过程.

　　组蛋白甲基化是另外一种重要的组蛋白修饰，这种修饰作用可使染色体的结构产生变化，也可通过其他转录因子来调控基因的表达，这是由甲基化的位点（赖氨酸或精氨酸） 和甲基化的程度（单甲基化或多甲基化） 所决定的。组蛋白甲基化是由组蛋白甲基转移酶（HMTs） 催化的，HMTs 分为两个家族，分别是组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMTs） 和组蛋白精氨酸甲基转移酶（HRMTs） ,其对基因表达调控的作用可以完全相反，某些可以激活基因的转录，而某些则会抑制基因的转录。目前报道的组蛋白甲基化位点包括组蛋白 H3 的 R2、K4、K9、R17、R26、K27、K36、K79 和 H4 的 R3、K20,催化这些位点的酶主要有三类，分别是蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs） 家族，催化赖氨酸甲基化的 SET 区域包含蛋白家族（SET DOMA IN-containingprotein） 以及非 SET 区域包含蛋白 DOT1 / DOT1L.

　　组蛋白的磷酸化修饰也是一种常见的基因转录调控方式，主要发生在组蛋白 H3 的第 10 位丝氨酸和第 28 位丝氨酸上，这两个位点都存在于一个相同的保守序列（-ARKS-） 中，它们的磷酸化与基因转录的起始和有丝分裂期染色质凝集有关.
组蛋白 H3 第 10 位丝氨酸是有丝分裂和基因转录调控过程中磷酸化激酶作用的主要靶点，通过磷酸化修饰可能改变了组蛋白的电荷，进而改变了组蛋白与 DNA 结合的特性，从而调控基因的转录活性。组蛋白的泛素化修饰是指细胞内大量的结构和调节性蛋白经泛素蛋白的附着而修饰，从而起到靶信号的作用，可将修饰的底物蛋白分配到细胞的不同部位，改变其活性，改变大分子间的相互作用及蛋白的半衰期。

　　SUMO 是一种泛素类似修饰物，能共价结合于组蛋白尾的赖氨酸残基上，此过程类似于泛素化，可能参与异染色质结构的调节。在 ATP 存在的情况下，经 SUMO 活化酶 E1,SUMO 结合酶 E2,SUMO 连接酶 E3 的作用，最终与组蛋白底物耦联。

　　2 组蛋白修饰与疾病

　　2. 1 组蛋白修饰与慢性肾脏病 慢性肾脏病是一种全球性疾病，美国有超过两千万人患有慢性肾脏病。越来越多的证据表明，表观遗传调控的基因表达在肾脏的发展和其他肾脏疾病中扮演重要角色.慢性肾脏病表现出多个表观遗传学相关疾病的特点： （1） 具有遗传性，但不能够被某种特定的遗传模型来解释； （2） 解释环境影响的证据； （3） 随着年龄增加发生率增加.一旦出现超过某个特定比例的肾单位丢失，即可出现特定信号通路导致的肾小球和肾小管间质纤维化。多种细胞因子、趋化因子和生长因子在基质的形成和降解中协同作用，导致细胞外基质（ECM） 的积聚失衡，最终肾小球硬化和间质纤维化.事实上，新兴的研究结果强调，表观遗传变化在肾脏疾病和终末期肾小球和肾小管间质纤维化进展中起到关键作用.以糖尿病性肾病（DN） 为例，细胞培养和动物模型的研究报告表明，表观遗传组蛋白翻译后修饰（PTMs） 参与关键基因的表达与 DN 的发病机制相关。β 转化生长因子（TGF-β） 在肾脏细胞纤维化和 ECM 基因的表达如胶原蛋白1α2、纤溶酶原激活物抑制物 1（PAI-1） 和 p21 细胞周期抑制剂中扮演一个重要的角色，这为 DN 的发病机制作出了贡献。TGF-β 主要通过激活的转录因子 Smad2、Smad3 和 Smad4,与 HAT 和染色质重塑因子结合调节基因的表达.TGF-β 通过招募 HATs 激活剂 p300、CREB 结合蛋白（CBP） 到 PAI-1、p21 启动子增加 Smad和 SP1 附近的 H3K9/14ac 结合位点。共转染实验表明，CBP 和p300 增加 p21 和 PAI-1 启动子的转录活性和增强 TGF-β 诱导的基因表达。在鼠系膜细胞（RMC） ,TGF-β 也增加 p300 和Smads2 /3、SP1 之间的联系，并增加了 Smads 乙酰化的作用.

　　在类似的系膜细胞模型激活子，TGF-β 诱导胶原蛋白1α1,结缔组织生长因子（CTGF） 和 PAI-1 增加甲基化标志的激活程度（H3K4me1、H3K4me2 和 H3K4me3） 并减少甲基化标志的抑制程度（H3K9me2 和 H3K9me3）.TGF-β 也诱导 HMT 中 SET7的表达并增强其招募 ECM 基因启动子。SET7 基因沉默废除TGF-β 诱导基因的表达，进一步确认了 SET7 在系膜细胞纤维化的基因表达的关键角色。上述研究表明 TGF-β 在 DN 表观遗传学机制中发挥着重要的作用。进一步的研究标明，阻断这些已经证实了的和肾脏纤维化的调控有关的组蛋白修饰通路非常重要，并可能被证明是一种有效地阻止慢性肾脏病肾脏纤维化过程的治疗靶点。

　　2. 2 组蛋白修饰与肿瘤 真核生物 DNA 具有复杂的结构

　　一般缠绕特定蛋白质的组蛋白形成一种叫作核小体的结构。

　　核小体由 4 组蛋白 H2A、H2B,H3 和 H4 组成。此外，组蛋白H1 形成 DNA 组装外的核小体。特定的组蛋白修饰酶可以添加或删除组蛋白的功能组，而这些修饰影响基因缠绕的组蛋白转录水平和 DNA 复制的水平。因此，有人可能认为健康细胞和癌细胞在组蛋白修饰的方面是不同的。与健康的细胞相比，癌细胞减少了组蛋白 H4 单甲基化和三甲基化的形成（H4ac 下降和 H4me3）.在鼠模型中，科学家们发现组蛋白 H4 乙酰化作用和三甲基化作用的丧失增加了肿瘤的生长.而在染色体终端 H4K16ac 的丧失，尤其是失去了乙酰化作用 H4K16ac的丧失是衰老的标志。肿瘤抑制基因 p53 调节 DNA 修复，可以诱导凋亡细胞特异基因表达。E Soto-Reyes 和 F Recillas-Tar-ga 阐明 CTCF 蛋白在调节 p53 表达的重要性。CTCF 或 CCCTC结合因子，是一个锌指蛋白，可通过抑制组蛋白修饰隔离 p53启动子。在某些类型的肿瘤细胞，CTCF 蛋白质通常是游离的，和 p53 启动子共同抑制组蛋白修饰，导致 p53 表达减少.表观遗传机制本身的突变也可能发生，可能导致癌细胞的表观遗传变化的特性。例如，H4K16ac 的减少可能是由于 HATs 的活性减低或增加了 SIRT1 去乙酰化作用。同样，HDAC2 灭活转移突变，组蛋白去乙酰酶，作用于许多赖氨酸组蛋白尾改变组蛋白乙酰化作用模式与癌症的发生相关.这些发现表明通过酶的抑制或增强改变表观遗传作用与肿瘤发病机制相关，但是紫外线、电离辐射、环境毒素和代谢的化学物质所致的 DNA损伤也会导致基因组不稳定性和癌症。DNA 双链断裂（DSB）所致的 DNA 损伤由组蛋白修饰介导。在 DSB,MRE11-RAD50-NBS1（MRN） 蛋白复合物招募毛细血管扩张性共济失调突变（ATM） 激酶丝氨酸 129 位点组蛋白 2A 磷酸化。中介的 DNA损伤检查点 1 结合磷酸肽和 H2AX 磷酸化可能通过 MRN-ATM招募和磷酸化的正反馈循环进行传播，然后 TIP60 多聚泛素化可使 γH2AX 乙酰化，在细胞周期 G2/ M 点 DNA 修复 1 型乳腺癌易感蛋白复合物亚基（BRCA1-A） 受体相关蛋白 80 附着于组蛋白导致其泛素化，阻止 BRCA1-A 激活，从而启动 DNA 修复或细胞凋亡.深入研究组蛋白密码有望在基因调控和肿瘤发生上获得新的突破，并可能提出新的治疗靶点，将成为今后肿瘤基因治疗的一个研究方向。

　　2. 3 组蛋白修饰与心脏病 缺血性心肌病（ICM） 是指由于长期心肌缺血导致心肌局限性或弥漫性纤维化，从而产生心脏收缩和（或） 舒张功能受损，引起心脏扩大或僵硬、充血性心力衰竭、心律失常等一系列临床表现的综合征。表观遗传在调节心脏肥大深远影响的重要性首先在操纵控制组蛋白乙酰化酶反映出来，组蛋白乙酰化尾巴的 HATs 中和组蛋白的正电荷，使核小体松散并促进转录。另一方面，脱乙酰作用由 HDACs 相互联系导致转录抑制。缺乏 HDAC1 和 HDAC2（I 型 HDACs） 的鼠显示严重心脏畸形和扩张性心肌病.I 型 HDAC 如HDAC3 的过度表达导致心室厚度增加，由于心肌细胞增生而不是肥大,而 4 月龄鼠特发性心脏病中 HDAC3 的缺如导致严重的心脏肥大.Ⅱ 型 HDACs （HDAC4,HDAC5 和HDAC9） 是重要的肥厚性基因的转录的信号传导介质.鼠HDAC5 或 HDAC9 的缺如导致应激性心脏肥大的加剧。最近Ⅲ型 HDACs 成员（例如 SIRT1 和 SIRT6） 成为重要的肥厚性反应的调节器,因为这些 HDACs 抑制肥厚相关性基因的表达并通过他们的功能依赖细胞 NAD + 程度抑制一些过度肥大代谢。HDAC4 对于人类心脏发展是非常重要的，因为最近发现其突变存在于先天性心脏病（CHDs） 伴有指过短智力缺陷综合征的患者。由此可见，HDACs 广泛参与疾病的发生发展，调控心肌供需氧平衡、能量代谢、血管内皮功能等多个方面，组蛋白乙酰化修饰与 ICM 密切相关，值得深入研究。

　　2. 4 组蛋白修饰与神经系统疾病 神经性疼痛造成外周或中枢神经系统的损坏，其特点是长期剧烈的疼痛。神经性疼痛的典型症状是自发性疼痛，并对触摸痛和热痛觉过敏，对常见的止痛药如阿片类药物和抗炎药物不敏感.越来越多的证据表明，免疫细胞浸润，如巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，产生多种炎性分子导致神经性疼痛.值得注意的是，这些细胞中巨噬细胞被认为是最重要的。Norikazu 的研究中指出，增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 嵌合子老鼠局部坐骨神经结扎（PSL） 后 1 d 和 7 d,在受伤的坐骨神经（SCN） 中骨髓（BM） 衍生细胞产生的 EGFP + 数量明显增加了，而在虚拟的 SBN 手术后几乎没有观察到 EGFP + 细胞。在 PSL 后1 d 和7 d H3K9Ac的标记定位于 EGFP + 细胞的细胞核中。与此同时，在受伤的SCN 观察到 EGFP + 细胞的细胞核中 H3K4me3 被标记。定量分析显示 H3K9Ac + 的百分比在受伤的 PSL 后 1 和 7 d 明显大于虚拟手术组。同样，PSL 后细胞核 H3K4me3 + 的百分比也增加了。因为浸润的巨噬细胞长期参与外周神经炎是至关重要的所在,需进一步验证是否组蛋白 H3 修饰发生在巨噬细胞。F4/80 + 巨噬细胞的数量在受伤的 PSL 后的 SCN 显然高于虚拟手术组。H3K9Ac 和 H3K4me3 也在 PSL 7 d 后的 SCN 中巨噬细胞的细胞核定位。研究结果显示 H3K4me3、H3K9Ac +、F4/80 + 的增加可能导致神经疼痛及外周神经炎症反应。此外，在早衰大鼠模型的皮质和海马部位，多个位点如 H3K24、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20 的甲基化发生改变.研究发现在亨廷顿病患者的大脑皮质，CBP 蛋白受损后 H3K9 甲基转移酶 ESET 的表达上调可导致 H3K9Me3 的显著提高.组蛋白修饰具有稳定的表达调控，因此对组蛋白修饰酶及下游靶基因的研究，将为某些神经系统功能变异或疾病的早期识别和治疗提供了理论依据。

　　2. 5 组蛋白修饰与内分泌疾病 组蛋白翻译后修饰通过招募染色质重塑蛋白质、转录激活和转录抑制共同调节染色质结构和基因表达。新兴证据显示了监管基因所涉及的关键蛋白翻译后修饰与糖尿病的发病机制有关。在葡萄糖体内平衡调节中胰岛素基因表达与胰岛分泌物在应对血糖水平的变化是一个关键的过程，也就是说糖尿病的异常调节。研究表明，特定的胰岛转录因子胰腺-十二指肠同源盒基因-1（Pdx-1） 可以通过表观遗传调控机制调节胰岛素调控过程。高糖基条件下，Pdx1招募 HATs 激活剂 p300、CBP 和 HMT 中的 SET7/9（SET7） ,从而增加 H3 /H4 乙酰化和 H3K4 二甲基化的表达激活，并分别在胰岛素启动子促进染色质构象开放形成转录复合物和增强胰岛素的转录.相反，在低糖基条件下，Pdx1 招募 HATs 抑制物 HDAC1、HDAC2,促进染色质凝集和抑制胰岛素表达.

　　有趣的是，Pdx-1 通过直接作用于 SET7 的启动子控制着胰岛的特异性表达.在代谢异常的发病机制中脂肪生成起着重要的作用，是由转录因子 CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP） β 和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR） γ 严格控制。组蛋白PTMs 和招募相应修饰的动态变化可以调节 C / EBPβ 和 PPARγ诱导基因表达参与脂肪细胞分化.在未来的一些年这显然是一个热门的研究领域，有可能这些导致糖尿病的病理表观遗传改变也直接或间接地导致靶器官并发症。

　　2. 6 组蛋白修饰与炎性病变 表观遗传通过组蛋白乙酰化的动态调节，可能在脓毒症的病理生理学方面扮演一个关键的角色。脓毒症诱导的材料和方法是通过在 BALB/c 小鼠盲肠的结扎和穿刺（CLP） 实验，手术前 3 h 给予一种新型广谱 HDAC抑制剂 CG200745（10 mg/kg） 或 I 型 HDACs 主要抑制剂丙戊酸（500 mg/kg） 腹腔内注射。结果 CLP 后肺部 HDAC1、HDAC2、HDAC3 蛋白质含量减少了。此外，在肺部 CLP 诱导的脓毒症组蛋白 H3 和 H4 的乙酰化水平增加。CG200745 给药后，产生强烈的凋亡诱导。

　　综上所述，组蛋白修饰与人类健康密切相关，当人们一旦明确疾病发生的机制后，就可运用修改组蛋白密码的技术来设计药物和提出措施，以改变或调整基因表达的状态和活性。这就可以解决很多利用传统的药物治疗和基因治疗行不能治愈的疾病，如 HDAC 抑制剂已在癌症、神经、循环系统疾病等方面开展了治疗研究，并且有些药物已经进行了临床试验。