0 引 言
镁合金良好的机械强度、低弹性模量及生物可降解性引起医学生物材料界的重视,具有很大的发展潜力[1]. 然而,镁合金降解速度快,在体内环境中未完成承力任务前就降解了,限制了他的应用。 通过镁合金表面改性,改善镁合金在人体体液环境中耐腐蚀性较差的问题[2-3],即可获得一种具有适宜降解速度且机械强度、弹性模量都比较好的生物材料。 羟基磷灰石(HA) 具有良好的生物相容性、生物活性及骨诱导能力,且耐腐蚀性较好,是一种理想的人工骨表面涂层材料[4]. 在镁合金表面涂覆一层羟基磷灰石,生成镁合金基HA 复合材料,该材料兼备了镁合金良好的机械性能、低弹性模量及生物可降解性,以及羟基磷灰石良好的生物相容性、生物活性及骨诱导能力,是一种 比 较 理 想 的 人 工 骨 材 料 或 人 工 骨 支 架材料[5-7].
目前通过电泳沉积法已成功的制备出镁合金基 HA 复合材料。 该复合材料的生物相容性[8-9]及生物活性[10-11],决定其能否作为人工骨材料长期存于体内并发挥功能与作用[12]. 为此,有必要验证镁合金基羟基 HA 复合材料的生物相容性与生物活性。 本研究采用动物体内埋植实验来研究镁合金基 HA 复合材料的生物相容性; 将制备好的镁合金基 HA 复合材料浸泡于 SBF(模拟体液) 中测试该材料的生物活性。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1) 实验主要材料
采用电泳沉积法制备好的镁合金基 HA 复合材料; SD 大鼠 8 只,来源于南华大学动物实验中心。
2) 实验主要试剂
无水乙醇(≥99. 7%) 、7% 的水合氯醛、组织固定液(10% 的福尔马林中性固定液) 、去离子水、SBF 溶液。
3) 实验主要设备
自制 SD 大鼠实验手术台(含手术刀、手术针、手术缝合线、镊子、剪刀等) 、X 射线衍射仪(XD-3) 、组织切片机、生物电子显微镜(PH50) 、电子分析天平(DV214C) 、电热恒温箱(SA2-WD-350) 、超声波清洗器 (KQ-100B) 、JSM-6490LA 型扫描电子显微镜。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 种植体预处理
将制 备 好 的 镁 合 金 HA 复 合 材 料 试 样(2 mm ×2 mm ×1 mm) 进行修整; 采用 X 射线衍射仪对试样进行 XRD 分析,以验证 HA 涂层的制备情况,并排除种植体含其它杂质污染的可能。 在动物埋植实验前,先将种植体试样浸泡于无水乙醇溶液中 30 min 进行消毒处理,防止细菌感染而引发炎症反应。
1. 2. 2 动物埋植实验
1) 分组及对照设计
实验在南华大学动物实验中心进行。 选取 SD大鼠 8 只,体重约 200 g,雌雄各半。 将实验大鼠分成两组: (1) 种植体组: 将制备好的种植体材料适当修整,植入到大鼠左侧后肢肌肉内,并对植入物进行包埋定位后缝合。 (2) 对照组(无植入材料单纯的损伤组) : 将大鼠相对应的左侧后肢肌肉组织剪开一个小口,对伤口定位后进行缝合。
2) 外科手术
用无水乙醇对植入大鼠体内的种植体进行消毒灭菌处理后,选用 7% 的水合氯醛作为麻醉剂药品,使用剂量为 0. 005 mL/g 麻醉剂药品对动物进行一次给药静脉全麻。 全麻醉成功后,将大鼠仰卧固定在实验手术台上,取左侧后肢内侧肌肉组织为植入部位,并对植入部位表皮去毛,采用络合碘溶液进行常规手术消毒,铺无菌手术巾。 将表皮切开一道两厘米左右的口子,然后使用镊子找到肌肉组织,通过手术刀将肌肉组织切开一小口,然后将种植体埋入肌肉组织,使用手术针和手术缝合线将肌肉组织缝合进行包埋定位,定位后将大鼠的表皮伤口缝合。 术后将实验大鼠放入动物饲养箱,不限制动物的自由活动。
3) 组织学检测
手术后饲养一定的时间(分别为 2、3、4 周) ,采用 7%的水合氯醛作为麻醉剂药品静脉注射麻醉动物,然后采用气体栓塞法处死实验动物。 处死后立即取材,将含有植入物及其周围的肌肉组织切下后,装入盛有组织固定液溶液的塑料标本管内进行组织固定,3 d 后取出整个肌肉组织,并将包埋的植入物取出后对周围组织进行组织切片、HE 染色处理,并置于生物显微镜下观察。
1. 2. 3 SBF 浸泡实验
取镁合金基 HA 复合材料样片 (9 mm ×9 mm × 2 mm) ,由于样片两面都有涂层,为了避免造成混淆,选择涂层完好的一面作为实验面,而另一面去掉部分涂层露出镁合金基体作为对照面。 将样片清洗后恒温(37 ±1 ) ℃浸泡于 SBF 溶液中,浸泡四周后取实验样片清洗、风干,进行XRD 分析。
2 结果与讨论
2. 1 种植体的表征
在 X 射线衍射仪上分别对 HA 粉体、镁合金基及种植体材料进行衍射实验,通过衍射图谱的对照与分析,确定种植体的物相组成。 如图 1 是镁合金、羟基磷灰石(HA) 和种植体材料(HA/Mg 复合材料) XRD 衍射图谱对比分析图。 HA/Mg 复合材料与 HA 粉体的主要衍射峰能较好地相对应,且除镁合金衍射峰以外无其它的衍射峰存在,说明电泳沉积制备的 HA/Mg 复合材料表面涂层主要成分是 HA,且无其它的杂质存在。 电泳沉积没有导致 HA 晶相变化,还是单一的 HA 晶相。 同时各衍射峰在高度及宽度上有所差别,相比 HA 粉体,种植体所含的 HA 衍射峰高度较低、宽度较窄,表明种植体中 HA 的结晶度相对较低、总量相对较少。
采用日本 JSM-6490LA 型扫描电子显微镜对制备的沉积涂层进行扫描,采用电泳沉积法制备的涂层表面微观形貌如图 2 所示。 由图 2 可知,涂层由针状的 HA 颗粒紧密排列而成,致密均匀,无裂纹,并完全覆盖了镁合金基表面。 采用粘接拉伸法测得涂层与镁合金基的结合强度约为 4 MPa.
通过对电泳沉积工艺参数的优化及沉积涂层后续热处理,能够得到了涂层与基体结合强度良好、表面微观性能适中的 HA/Mg 复合材料。
2. 2 动物实验
实验鼠术后切口轻度红肿,无渗透,大约两周后伤口痊愈。 种植体埋入大鼠肌肉组织后,分别以术后 2 周、3 周及 4 周分批处死实验大鼠,解剖发现种植体周围软组织均无明显的充血、积液、变性、坏死及化脓等表现。 术后有轻微的炎症反应,存在少量的炎细胞浸润; 随着术后时间的延长,纤维结缔组织增生明显,逐渐形成纤维囊并包裹着种植体,周围组织浸润的淋巴细胞、巨核细胞等炎细胞逐渐减少。 这表明了 HA/Mg 复合材料引起机体的炎症反应、免疫反应不明显,无毒性,与机体相容性较好。
种植体不同埋植时间周围组织切片如图 3 所示,图 3a 为实验对照组,图 3b、3c、3d 分别为种植体埋入 2 周、3 周以及 4 周的组织切片图。 相比对照组,图 3b 周围组织有少量结缔组织增生及新生血管的形成,并有较多的淋巴细胞、巨核细胞等炎细胞的浸润,分布均匀; 图 3c 与图 3b 相比,周围组织淋巴细胞、巨核细胞等炎细胞浸润相对较少,结缔组织增生明显,但是没有形成纤维囊; 图 3d中埋植物周围未见大量多核巨细胞及中性粒细胞等炎细胞的浸润,且有大量的纤维结缔组织增生,纤维结缔组织包裹种植体形成纤维囊。 由于取下种植体时,依附在种植体表面的纤维组织被撕下,图片 3d 中纤维囊局部位置无纤维结缔组织而形成光滑的曲面。
对取出的种植体进行肉眼观察及称重测量,发现种植体几乎没有发生降解且重量变化幅度小,这说明了种植体表面 HA 涂层在一定的时间内能阻缓镁合金基体的腐蚀。
2. 3 SBF 实验
HA / Mg 复合材料浸泡前表面 HA 涂层为针状的 HA 颗粒紧密排列,且 HA 涂层表面无晶体沉积。
浸泡于 SBF 溶液四周后,镁合金基 HA 复合材料表面不但没有被腐蚀,其表面涂层厚度反而增加,有一层白色覆盖物沉积于涂层表面。 图4 为 HA/Mg 复合材料浸泡于 SBF 溶液四周后的 SEM 图,通过图4 观察可知,排列紧密的针状形的 HA 表面有一层白色的晶体覆盖,并形成块状的覆盖物。
经如图 5 的 XRD 分析,该覆盖物具有磷灰石晶相,相比浸泡前,浸泡后的涂层中所含的磷灰石的 XRD 衍射峰强度增加,而镁合金 XRD 衍射峰强度降低。 表明了浸泡后的复合材料所含磷灰石成分增加,羟基磷灰石(HA) 能诱导磷灰石的形成。 然而对照面去掉涂层部分的地方腐蚀相当严重,镁合金基底基本完全被腐蚀了。 说明了羟基磷灰石(HA) 在体液环境耐腐性较好,能减缓镁合金在体液环境中的腐蚀速率。
3 结 论
动物埋植实验表明电泳沉积法制备的镁合金基 HA 复合材料引起机体免疫反应不明显,无细胞毒性,不产生炎症反应,具有良好的生物相容性。 SBF 浸泡实验表明镁合金基 HA 复合材料能够促进钙的沉积,诱导类骨磷灰石的形成,具有良好的生物活性。 动物埋植实验和 SBF 浸泡实验同时验证了镁合金基 HA 复合材料具有良好的耐腐蚀性,说明了 HA 能减缓镁合金的腐蚀速率,使得镁合金在预定的服役期内满足机械性能要求。
参考文献:
[1]曾荣昌,孔令鸿,陈君,等。 医用镁合金表面改性研究进展[J]. 中国有色金属学报,2011,21(1) : 35-43.
[2]郭洁,唐舟,朱伟,等。 表面改性在医用镁及镁合金材料研究中的应用[J]. 生物骨科材料与临床研究,2009,6(4) : 38-41.
[3]张晓,梁敏洁,廖海洪,等。 生物医用镁合金腐蚀与防护的研究进展[J]. 热加工工艺,2014,43(8) : 9-12.
[4]李俊杰,姚晖,陈亦平,等。 微纳米羟基磷灰石及其复合材 料 研 究 进 展[J]. 化 工 进 展,2006,25 (6) :651-657.
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