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基因测序技术的基本原理和应用特点

来源:学术堂 作者:原来是喵
发布于:2016-11-21 共8685字
  基因测序技术已发展至第四代,其中第二代、第三代和第四代测序技术统称为下一代测序(NGS)技术。下面由学术堂为大家整理出一篇题目为“基因测序技术的基本原理和应用特点”的医学技术论文,供大家参考。
  
基因测序技术的基本原理和应用特点

  原标题:下一代基因测序技术新进展
  
  摘要:基因测序技术已发展至第四代,其中第二代、第三代和第四代测序技术统称为下一代测序(NGS)技术。基因测序原理也相应地经历了Sanger测序法,边合成边测序、单分子测序和纳米孔测序。NGS技术因为通量提高、成本降低和测序周期缩短的优势已被广泛应用于基因组学、转录组学、宏基因组学和表观组学等方面。本文就NGS技术的基本原理和应用特点进行综述。
  
  关键词:下一代基因测序技术;单分子测序;纳米孔测序
  
  基因测序技术的出现对生命科学和医学的发展起到了革命性作用,不仅推动各类基因组学的研究[1],为复杂疾病的病因学研究提供了新思路[2],还促进了基因检测在产前诊断、器官移植配型、肿瘤分子诊断和靶向治疗以及在药物个体化治疗等方面的应用[3-4].作为基因组学研究的关键技术--基因测序技术在过去的38年里迅速发展。自1977年Sanger发明链终止双脱氧链终止法 (Sanger测序法)、Maxam和Gilbert发明化学降解法测序技术以来,基因测序技术不断发展,作为第一代基因测序技术代表的ABI3700荧光标记自动核酸分析仪 (Sanger测序法) 将基因测序带入自动化时代。2003年完成的人类基因组计划测序长度达30亿个碱基对[5].然而,第一代测序技术无论在通量、成本、读长、测序速度和数据分析系统等方面都不能满足日益增长的全基因组测序需求,因此出现了下一代测序 (next generation sequenc-ing,NGS) 技术。NGS技术又称大规模平行测序或深度测序[6],包括第二代、第三代和第四代测序技术。目前,具代表性的第二代测序平台有瑞士Roche公司的454,美国Illumina公司的基因组测序仪 (genome analyzer,GA)、Hi Seq 2000和Mi Seq,美国ABI公司的寡聚物连接检测测序(sequencing by oligo ligation detection,SOLi D)5500XL,美国Life Technologies公司的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪 (personal genome ma-chine,PGM);第三代测序平台有美国HelicosBiosciences公司的Heli Scope遗传分析系统和Pa-cific Biosciences公司的单分子实时 (single mole-cule real time,SMRT) 测序技术;第四代测序技术有英国Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔测序技术。本文拟综述这些测序技术的基本原理和应用特点。
  
  1第二代测序技术
  
  Sanger测序法是测序技术的金标准,其测序长度可达1 000 bp,准确性几乎100%,但存在通量低、成本高和耗时长的不足,严重影响其大规模应用,为此产生了第二代测序技术。第二代测序技术的核心原理是边合成边测序,其基本步骤包括文库制备、单克隆DNA簇的产生和测序反应。与第一代测序技术相比,第二代测序技术具有以下特点:(1) 高通量。第二代测序技术不依赖传统的毛细管电泳,其测序反应在芯片上进行,可对芯片上数百万个点同时测序[7];(2) 成本 降 低 . 第 二 代 测 序 技 术 每Mb碱 基 成 本 比Sanger测序法降低96.0%~99.9%[5];(3) 敏感性高,如Roche 454测序平台“1个片段=1个磁珠=1条读长”的设计能保证对低丰度DNA信息的检测;(4) 读长较短,不便于后续数据分析时的拼接;(5) 聚合酶链式反应 (polymerase chain reac-tion,PCR) 过程可能引入偏倚和错配。
  
  1.1 Roche 454测序平台
  
  Roche 454(Genome Sequencer 20 System)是第一个NGS测序平台,由美国454 Life Sciences公司于2005年推出,2007年被瑞士Roche公司收购。此后Roche公司在此基础上开发了Roche GSTitanium、Roche GS FLX +、Roche GS Junior和Roche GS Junior+[8].Roche 454是一种基于微乳液PCR和焦磷酸测序技术的测序平台[9].Roche 454测序原理见图1.首先单链DNA模版被限制在经乳化的磁珠上并在乳液滴中进行微乳液PCR,产生成千上万条待测模板DNA簇。随后将磁珠放置在有焦磷酸测序底物的微滴定板小孔中进行酶联化学发光反应,对单条DNA分子的多个拷贝进行大规模平行测序[10].Roche 454测序平台具有较长的测序读长和短耗时的优势,如Roche GS FLX+读长达1 kb,一轮测序时间仅为23 h[8].Roche454测序准确性高达99.9%,达到了与Sanger测序法相当的长度与准确性,并降低了测序成本。Roche 454测序主要应用领域有微生物群落多样性分析 (如16s、18s、ITS扩增子测序)、复杂环境样品的宏基因组学研究、微生物基因组的从头测序、转录组测序、外显子测序、目标区域捕获测序和病原菌检测等[11].然而,Roohe 454平台也存在一些不足,比如焦磷酸测序试剂成本相对较高,样本制备相对较复杂,对重复和同种碱基聚合区域难以处理,以及试剂冲洗带来的错误积累等。随着测序仪器的更新,454平台无论从扩展性还是从成本来看都很难再次升级和改良,故Roche公司宣布自2016年逐步淘汰焦磷酸测序仪器的生产[7].
  
  焦磷酸测序原理示意图
  
  1.2 Illumina测序平台
  
  美国Solexa公司于2006年推出GA,2007年被Illumina公司收购,此后Illumina公司又开发了GAⅡX、Hi Seq 2500、Hi Seq 3000、Hi Seq 4000、Hi Seq X Ten、Hi Seq X Five、Next Seq 500、Mi Seq系列和Mini Seq系统[12].Illumina测序平台是基于桥式PCR和荧光可逆终止子的边合成边测序,其测序原理见图2.单链DNA固定在8通道的芯片表面形成寡核苷酸桥,芯片置于流通池内,经过PCR扩增各通道均产生不同单克隆DNA簇。加入DNA聚合酶和4种荧光标记的d NTP可逆终止子后进行合成反应,每次只增加单个碱基,合成的同时检测其荧光信号确定碱基类型,之后切掉d NTP 3‘端延长终止基团,继续添加碱基进行测序反应。Illumina在NGS平台中通量最高,如Kampmann等[13]采用GAⅡX在一个通道中一个测序循环内完成了9个甲型流感病毒标本的全基因组测序工作。新推出的Next Seq 500兼具了样品制备和测序功能,其按钮式的操作可以在许多常见测序应用之间切换。该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达16个外显子组,Next Seq500运行75个测序循环只需12 h. 此外,Illumina测序成本最低,因此应用最广泛,几乎涵盖了测序应用的各个方面,比如基因组学的全基因组从头测序、重测序、外显子和目标区域捕获测序;转录组学的转录组测序、数字基因表达谱测序、微小RNA测序和降解组测序;表观组学的甲基化测序、简化甲基化测序和甲基化DNA免疫共沉淀测序等[11].然而,Illumina平台由于读长较短,会导致后期用于数据删节和分析的费用增高。
  
  Illumina测序原理示意图
  
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