有机化学论文
低剂量率辐照会产生两种效应：低剂量刺激效应和辐射损伤效应。极低剂量率为正效应，可诱导农作物性状改良[1]和品种改良、临床上杀灭癌细胞的同时保护机体细胞。辐射损伤为负效应，可导致DNA双链和单链断裂[2],红细胞及膜损伤[3],胸腺细胞凋亡[4]和癌细胞自我修复增强以及航空、军事和工业元器件[5-6]的应用性能下降。明胶辐照灭菌已沿用传统工艺多年，应用发现，辐照后明胶出现黏度下降的现象。当明胶的初始带菌量高、初始黏度低时，辐照后的明胶细菌含量符合要求，但黏度大幅下降，由此降低或失去应用价值（GB 6783-94要求：明胶勃氏黏度大于1.8mPa·s,凝冻强度大于100g）[7].但这种现象在同等剂量加速器辐照或装源量大的钴源辐照时可避免。因此，研究低剂量率损伤效应具有重要意义。
水、蛋白质和氧气辐照分解产生OH·、H·、e-aq、HO2·、O-2、RCH·CO-2、NH+3C·（R）CO-2等自由基[8],这些自由基间、自由基与分子间、分子内、分子间会发生多级反应，引起明胶分子的交联、断裂及其他变化[9].由于自由基含有未成对电子，具有自旋角动量，能产生磁性和自旋磁矩[10],常用电子自旋共振（ESR）谱仪检测其信号强度和自由基浓度[11-13].ESR技术主要应用于木荷、丝绸[14]、聚丙烯腈纤维[15]、化学反应研究[16]等领域，用于研究剂量率辐射损伤效应的报道较少。
本文采用ESR等技术，检测明胶经不同剂量率钴源和加速器辐照后，自由基含量及结构的特性变化，探讨剂量率对明胶辐射损伤的效应，为建立高剂量钴源（或加速器）辐照明胶灭菌工艺提供参考。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
明胶：CP级，国药集团化学有限公司。
钴源1:放射性活度1.22×1016Bq（33万Ci），湖北省辐照实验中心；钴源2:放射性活度9.36×1016Bq（253万Ci），深圳市金鹏源辐照技术有限公司；加速器：10MeV、15kW,深圳戈瑞辐照科技有限公司；JES-FA200电子顺磁共振波谱仪：日本电子株式会社；凝胶渗透色谱：1515型高效液相色谱泵、2690D型分离模块、2410型折射率检测器、Waters ultrahy dro-gel 2000型和Waters ultrahy drogel 250型色谱柱，美国Waters公司；Quanta 200型扫描电镜：荷兰FEI公司；TA-XTPlus型质构仪：英国SMS公司；50mL稀释型乌氏黏度计；电子万能材料试验机：深圳市瑞格尔仪器有限公司。
1.2辐照处理及剂量监测结果
将明胶在50℃下鼓风干燥至恒重后，进行定量有氧包装。包装后的明胶分别用钴源1（剂量率约为60Gy/min）、钴源2（剂量率约为480Gy/min）和加速器（剂量率约为1 200Gy/min）辐照，以硫酸亚铁剂量计跟踪吸收剂量。加速器工作条件：功率14.97kW、扫描电流7A、速度2.4~3.0m/min、载高3cm、加速电压122kV.钴源1辐照样品的吸收剂量分别为4.5、8.7、13.0、17.3、27.3、36.6kGy,钴源2辐照样品的吸收剂量分别为8.8、20.2kGy,加速器辐照样品的吸收剂量分别为8.0、30.6kGy.
1.3 ESR工作条件
初始场的磁感应强度为313.894mT,中心磁场的磁感应强度为323.894mT,磁场扫描宽度为20mT,扫描时间为60s,微波频率为9 052.252MHz,微波功率为0.998 000mW,测量温度为室温。
1.4指标测定
相对分子质量大小及分布宽度：以0.1mol/mL Na2HPO4（pH=8.0）为储备液，0.025mol/mLNa2HPO4（pH=8.0）为淋洗液，H2O-0.2mol/mLNaNO3为溶剂，进样量为100μL,淋洗液流速为0.6mL/min.标样为聚乙烯乙二醇，柱子温度为40℃,检测器温度为40℃。
特性黏度：记录在37℃恒温下，一定体积、不同浓度（初始浓度c0及将初始浓度按体积比稀释为2/3、1/2、1/3和1/4浓度）下明胶水溶液流经乌氏黏度计毛细管的时间。根据溶液流出时间t和蒸馏水流出时间t0,依次计算相对黏度ηr（ηr=t/t0）和增比黏度ηsp（ηsp=ηr-1）.以浓度c为横坐标、ηsp/c和lnηr/c为纵坐标作图，两条曲线与纵轴的截距记为H1和H2,其平均值为H,H/c0即为特性黏度[η].
凝胶强度：按美国试验标准GMIA采用质构仪测定。
断裂伸长率：采用膜的拉伸模式试验标准GB 1040-92进行断裂伸长率的测定。测试条件：定伸长率20%、标距25mm、试验速度100mm/min、定应力0.1mPa、试验面积1.56mm2,测试时输入膜厚度参数（以mm为单位），断裂伸长率由计算机直接给出。
表面形貌分析：10%的明胶水溶液在低温下形成凝胶后，在-80℃冰箱内速冻，再冻干，取少量冻干样品，真空喷金后，采用扫描电镜对样品的表面和截面扫描。
2结果与讨论
2.1辐照明胶的ESR谱特征
吸收剂量约8kGy的明胶经钴源1、钴源2和12 000Gy/min加速器辐照后，用ESR谱仪研究不同剂量率γ射线和电子束照射后明胶自由基信号的变化，结果示于图1.图1a显示，未辐照明胶的自由基信号很弱，且噪声较大。图1b显示，钴源1和钴源2辐照明胶后，自由基信号强度相近，加速器辐照后自由基信号强度最低，三者均表现出典型的特征双吸收峰，几乎重叠。
钴源1、钴源2和加速器辐照后吸收剂量分别为36.6、20.2和30.6kGy的样品的ESR谱如图2所示。与8kGy低剂量辐照明胶的ESR谱（图1）相比，随着剂量的增加，三种剂量辐照明胶的峰形无明显变化。吸收剂量较接近的钴源1（36.6kGy）和加速器（30.6kGy）辐照明胶的峰形高且窄，吸收剂量仅为20.2kGy的钴源2辐照明胶的峰形矮且宽。
根据分裂因子计算公式g=0.071 45γ/H（H为共振场的磁感应强度，γ为微波频率，取9 052.252MHz）和图2计算g值和ΔH（峰与峰对应磁场的间距），结果列于表1.由表1可见，钴源1的特征峰参数与加速器的较接近，钴源2的g值略偏大，ΔH偏小，但差值不大。可见，辐照剂量率并未改变样品的自由基性质，ESR谱峰形相似，未辐照明胶几乎无响应信号。低剂量阶段（图1），高剂量率的低自由基信号强度效应较明显，自由基信号强度由小到大依次为加速器、钴源2、钴源1.
电磁波或电子束在明胶蛋白质晶格内会产生辐射缺损，诱导长寿命自由基产生，当与周围外加磁场相互作用时，会发生自旋共振吸收。钴源和加速器产生的电子自旋和外加磁场间的相互作用不同，因此形成的谱线线形也略有差异[8,15].本研究发现，二者产生的自由基的特征峰相似，但强度有差异。
2.2剂量对自由基信号强度的影响
用钴源1对明胶进行不同剂量辐照，研究吸收剂量与自由基信号强度的关系，结果如图3所示。在0~36.6kGy吸收剂量范围内，自由基信号强度（y）与剂量（x）呈现良好的相关性，拟合方程为：y=26.983x2+1 641.8x-205.69,R2=0.994 .当物质受到电离激发时，处于上下两能级的电子发生受激跃迁，一部分低能级电子吸收电磁波能量跃迁到高能级，辐射诱发的顺磁性物质产额与吸收剂量直接相关[18],因此，ESR反映的是一定条件下样品吸收的总能量[19],能量吸收越多，共价键断裂越多，从而自由基含量越高[20].本研究中吸收剂量与信号强度呈正相关，与文献[21]报道的结果一致。
2.3剂量率对辐照明胶自由基信号强度的影响
用不同剂量率及辐照方式辐照明胶，其自由基信号强度示于图4.由图4可见，吸收剂量约为8kGy时，钴源1、钴源2和加速器辐照三种方式中，加速器辐照的明胶自由基信号强度最低，钴源1和钴源2辐照的明胶自由基信号强度相近；吸收剂量约为20kGy时，钴源2辐照的明胶自由基信号强度低于钴源1的；吸收剂量约为30kGy时，加速器辐照的明胶自由基信号强度低于钴源1的。可见，相同剂量辐照时，自由基信号强度由高到低依次为：钴源1、钴源2、加速器。
加速器辐照产生的自由基信号强度低于γ射线的，可能是由于加速器电子束穿透能力有限，且作用时间短，单位时间自由基产生量大，使自由基瞬时浓度太高，难以及时扩散，自由基间发生反应而淬灭，造成自由基总量减少。在钴源辐照中，大剂量率与小剂量率自由基信号强度产生差异与此推理相似，具体机理有待进一步分析研究。
2.4剂量率对辐照明胶平均相对分子质量的影响
吸收剂量约为8kGy时，不同剂量率辐照后，明胶流经凝胶渗透色谱（GPC）的信号响应值随时间的变化示于图5.由图5可见，钴源1辐照后明胶的保留时间最长，响应信号峰最矮；加速器辐照与钴源2辐照后明胶的保留时间相近，但钴源2峰较高。由GPC测定原理可知，相对分子质量越大，保留时间越短，峰越高。可见，相同吸收剂量下，钴源2辐照明胶样品平均相对分子质量最大，其次为加速器辐照的，钴源1辐照的最小。
根据明胶GPC响应值与标准曲线对比，分析得到相对分子质量。钴源1、钴源2和加速器辐照明胶的相对数均分子质量（Mn）分别为2 810、3 875和3 358;相对重均分子质量（Mw）分别为4 389、7 119和5 973;多分散指数（Mw/Mn,用于衡量聚合物分子质量分布的宽度，该值越大，说明分子质量分布越宽，分子质量越不集中）分别为1.56、1.84和1.78.在35~40min之间出现小峰的原因是明胶大分子流出后，小分子保留在树脂孔里，最后才被洗脱出来，倒峰为溶剂峰。由此可见，相同吸收剂量下，辐照明胶的Mn、Mw由大到小依次为：钴源2、加速器和钴源1.但分散指数以钴源1最低，其次为加速器，钴源2最高。
高分子受辐照后最重要的反应为辐照交联与降解，同时性能发生显著变化，包括分子质量增加或下降。在相对无水条件下，明胶属于辐照降解型高分子，在辐照过程中分子质量逐渐减小。在降解过程中生成大分子自由基，空阻效应使大分子自由基较稳定，它们很难在分子链内迁移，也不易进行分子间的双基复合反应，其主要反应趋势是重排或歧化反应，主链断裂后被稳定下来。这是明胶受γ射线辐照后，产生稳定性较好的自由基的机理。因此，稳定自由基含量可间接反应降解程度。
2.5剂量率对辐照明胶特性的影响
不同剂量率辐照后明胶的特性黏度、凝胶强度和断裂伸长率列于表2.由表2可见，未辐照明胶的特性黏度为47.5mL/g,辐照明胶的特性黏度在41~42mL/g范围内，且钴源2和加速器辐照后明胶的特性黏度相近，钴源1辐照后明胶的特性黏度略低。未辐照明胶的凝胶强度为642.8g,辐照明胶的凝胶强度在560~590g范围内，凝胶强度的大小依序为：
钴源2辐照后的明胶、加速器辐照的明胶和钴源1辐照的明胶。未辐照明胶的断裂伸长率为221.3%,辐照明胶的断裂伸长率范围为160%~200%,断裂伸长率由大到小依序为钴源2、加速器和钴源1.
综上所述，钴源剂量率加大，有利于减少无水明胶蛋白的降解，保持较高的特性黏度、凝胶强度和明胶膜的断裂伸长率。加速器辐照效果略次于钴源2的辐照效果，但优于钴源1的辐照效果。
有研究[3]表明，高剂量率辐照造成R·和ROO·的浓度相对较高时，自由基间的反应取代了自由基与完整分子间的反应，致使由·OH引发的链式反应蔓延过程受到限制，主要是链终止反应。相反在低剂量率时每个单位时间内几乎均未形成脂质过氧自由基ROO·，而是与相邻完整分子的反应导致链式反应被延长，故低剂量率对蛋白质产生更大程度的损伤。长寿命自由基对照后贮藏期明胶性能的影响有待进行深入、系统的研究。
2.6剂量率对辐照明胶微观结构的影响
图6为未辐照明胶和吸收剂量约8kGy的明胶表面放大500倍的扫描电镜图像。由图6可见：未辐照明胶表面有少量凹陷，且有明显未溶解的颗粒状物；三种辐照方式下，明胶表面孔洞数量较未辐照明胶均有所增加，但随着剂量率的增加，孔洞变浅，且逐渐模糊。钴源1辐照明胶表面孔洞稀疏、大、深，基质表面光滑，钴源2和加速器辐照的明胶表面孔洞逐渐变得不明显，且凸起物密集，尤其是加速器。对于孔洞，推测是明胶凝胶在冷冻干燥过程中水分挥发形成的通道。对于突起物，分析是由于明胶溶解性差，在水溶液中分布不均造成的。明胶经不同剂量率辐照相同剂量后，分解反应程度不同，水溶解性不同，分解程度越大，溶解性越好，则凸起物越少，基质越光滑。由6图还可见，剂量率越大，明胶辐照分解越少，表面突起越多。
3结论
1）未辐照明胶的ESR信号很弱，辐照明胶的ESR谱呈双峰特征，峰高由高到低依次为：60Gy/min钴源辐照的明胶、加速器辐照的明胶和480Gy/min钴源辐照的明胶；2）明胶的平均相对分子质量、特性黏度、凝胶强度、断裂伸长率由大到小依次为：480Gy/min112 000Gy/min加速器辐照的明胶、60Gy/min钴源辐照的明胶；3）明胶的相对分子质量越小，水溶解性越好，SEM图像表面越光滑，因此其表面粗糙程度由大到小的顺序与平均相对分子质量的相同。4）自由基浓度越高，辐射化学反应越激烈，性能劣变程度越大。高剂量率产生低浓度长寿命自由基，有利于减小辐射损伤，其作用机理可能是：瞬时高浓度自由基间反应增加而带来自由基的淬灭，减少了自由基对主链分子的攻击机会。
具体机理有待进一步脉冲辐解研究加以佐证。
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