有机化学论文
1 引言
DNA 纳米结构由于精确可控的几何外形而在众多领域有着潜在应用[1]. 与无机纳米材料相比, DNA纳米结构的合成遵循 Watson-Crick 碱基互补配对原则, “自下而上”制备, 具有很多独特的性质: 尺寸和形状精确可控、化学反应活性、空间可寻址性等. 迄今为止, 研究者们已经成功制备了大小形状可调节、机械性能各异、表面修饰多样的二维和三维 DNA 纳米结构[2~5], 并实现了 DNA 纳米结构与其他材料的共组装[6~11]. DNA 四面体[12]是最常见的一种 DNA 纳米结构, 结构简单(4~6 条 ssDNA 组成)、易大量制备、尺寸大小可通过棱长调节, 而且具有多个可修饰位点, 在生物传感器领域中得到应用并表现出了很好的效果[13]. 此外, DNA 四面体还可以用作载体把蛋白质[6,7]或其他分子运送到细胞或者活体内部[14,15].
近年来, DNA 四面体穿过细胞膜的方式及其在胞内运输的途径等研究也有了突破性的进展[16]. 然而, 由于 DNA 错误折叠等现象存在, 获得高纯度、高产率的DNA纳米结构依然是一个挑战, 成为DNA纳米技术应用的瓶颈问题. 因此, 发展简单、高效的纯化方法也成为人们关注的热点.
目前, DNA 纳米结构纯化最常用的方法是凝胶电泳, 包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和琼脂糖凝胶电泳. 尽管电泳方法分辨率很高, 但是存在一些问题, 如回收率偏低、规模小、费时繁琐且存在 DNA嵌入染料或者凝胶残余等的污染. 最近 Shih 课题组[17]
首次报道了使用甘油速率区带离心法纯化一系列较大的三维 DNA 折纸纳米结构的方法. 这种方法主要是利用单体与其各种副产物如聚集体以及原料如订书钉链(staple 链)的沉降系数的不同而进行分离,其分辨率较低, 对于沉降性质差别较小的结构分离能力较差, 且对于较小的 DNA 纳米结构也无能为力.因此建立一个高分辨率、快速简便、可大规模纯化的方法对于 DNA 纳米结构的应用非常重要. 本文提出将传统的高效液相色谱(HPLC)用于DNA纳米结构的分离纯化的方法.HPLC 是一种经典的分离技术, 分辨率高、可以高通量回收、可自动化, 广泛应用于分析化学领域和生化领域. 最近 HPLC 在纳米材料领域也有较多应用,已用来纯化量子点[18]和金纳米粒子[19]等. 阴离子交换色谱(AEC)非常适合于 DNA 的分离纯化, 可用来分离各种 DNA 结构, 包括短的单链 DNA 和双链DNA, 长的 PCR 产物和质粒 DNA 等. 它的分离原理是在阴离子交换树脂(固定相)上含有两种基团: 固定不动的阳离子基团和可交换的阴离子基团, 待测阴离子可与阳离子基团结合, 但这种结合是可逆的, 可被流动相中的阴离子交换, 当流动相阴离子浓度增加到足够强度时, 待测阴离子便会被完全交换下来,从而达到分离纯化的目的. DNA 是一类多阴离子的聚合物, DNA 结构越大, 阴离子越多, 与固定相亲和性越高, 这种结构差异导致的性质差异可以被 HPLC有效区分.
本文拟用 AEC 方法分离 5 种 DNA 四面体, 棱长分别为 13 (实验室自主设计)、17[12]、20[20]、26[10]和 30 bp[15], 依次命名为 TH13、TH17、TH20、TH26和 TH30; 此外, 还制备了 20 bp 棱长的三角双锥[21],命名为 TB20, 考察 AEC 对 DNA 纳米结构的分离效果.
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
三羟甲基氨基甲烷(Tris base)购自 Aladdin(中国), 纯度99.9%; NaClO4H2O 购自 Sigma-Aldrich 公司(美国), 纯化等级为 HPLC 级, 纯度99.0%;GelRed DNA 染料购自 Biotium 公司(美国); 其他试剂均从国药集团化学试剂公司(中国)购买. 整个实验所用的水为 Milli Q 水, 18 MW cm. MWCO 30 kDa 滤管购自 Millipore 公司(美国); 阴离子交换色谱柱购自Thermo Scientific 公司 ( 美国 ), 型号为 DNAPacTMPA-100 BioLCTM Analytical 4×250 mm; DNA 寡核苷酸购自 Invitrogen 公司(美国), PAGE 纯化, DNA 序列见表 S1 (网络版补充材料).紫外-可见分光光度计(Hitachi U-3010, 日本);PCR 仪(applied Biosystems Veriti 96 well ThermalCycler, 美国); HPLC 系统: Waters 1525 泵(美国)、Waters 2998 光电二极管阵列检测器(美国); 核酸蛋白质微量定量仪(IMPLEN NanoPhotometer P330, 德国); 化学发光成像系统(Syngene G:Box Chemi-XL,英国).
2.2 实验方法
2.2.1 DNA 四面体及三角双锥的自组装
DNA 四面体通过一步退火来合成, 将各组分单链(4~6 条), 在 TM 缓冲液(0.01 mol/L Tris-HCl, 0.005mol/L MgCl2, pH 8.0)中等摩尔混匀, 通常 DNA 四面体各链终浓度为 1×10-6mol/L, 而 DNA 三角双锥为1.7×10-7mol/L, 然后在 PCR 仪预设程序中退火, 预设程序一般为 95℃加热 10 min, 迅速冷却至 4℃, 在4℃停留 20 min 后取出样品, 即完成组装.
2.2.2 阴离子交换色谱(AEC)纯化 DNA 四面体及三角双锥
HPLC 所用流动相 A 为 0.025 mol/L Tris-HCl,0.375 mol/L NaClO4, pH 8.0; 流动相 B 为 0.025 mol/LTris-HCl, pH 8.0. 各个结构所用的洗脱方法见表 S2,DNA 四面体中 TH20 采用 AEC-1 程序, 其他采用AEC-2 程序进行分离, DNA 三角双锥使用 AEC-3 程序进行分离, 260 nm 波长检测并对产物进行收集.