成年大鼠盆神经节神经元的体外培养方法建立

　　神经细胞的体外培养不仅能够保持神经元的结构和功能,还能排除在体混杂因素的影响,为神经系统疾病的研究提供一个有效的研究对象.神经细胞分化程度高,生长需要较高的营养条件,体外培养十分困难.成功建立体外培养的技术方法对研究神经细胞的形态、功能具有十分重要的意义.本研究旨在建 立成年大鼠盆神 经 节 (major pelvic ganglia,MPG)神经元的体外培养方法,为MPG神经元的进一步研究提供基础.

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1实验动物MPG神经元体外培养采用成年雄性SD大鼠(3个月左右),体重约200g左右,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.DMEM/F12、Neurobasal、B27、penicillin/strepto-mycin及L-谷 氨 酰 胺 购 于Gibco公 司;胎 牛 血 清(FBS)、多聚左旋赖氨酸、胰蛋白酶、胶原蛋白酶、神经微丝单克隆抗体(neurofilament 200,NF-200)购于Sigma公司;鼠尾Ⅰ型胶原蛋白购于杭州生友公司,Fluorescein-Goat Anti-Mouse IgG购 于Pierce公司,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)购于Roche公司.

　　1.2方法

　　1.2.1成年大鼠MPG的取材10%水合氯醛腹腔麻醉后无菌条件下迅速取出双侧盆神经节[1],放入含D-hanks液(4℃)的培养皿中.在解剖显微镜下显微器械仔细剥离盆神经节周围组织显露神经节.整个取材过程在冰上进行,能更好的保持细胞活力.

　　1.2.2成年大鼠MPG神经元的植块培养用显微剪将MPG组织块剪成0.5mm3左右的小块,显微镊将MPG植块种植到鼠尾Ⅰ型胶原蛋白预先包被的加入少许血清培养基的培养皿上.待植块静置5min后将培养皿缓慢放入37 ℃、5% CO2培养箱中进行体外培养.待植块贴壁12h左右开始添加无血清限制性培养基.以后每隔2-3d半量换液一次,在倒置相差显微镜下观察植块的生长状态.在添加培养基或镜下观察的过程中操作务必缓慢轻柔,以免影 响 植 块 的 贴 壁.本 实 验 中 血 清 培 养 基 包 括DMEM/F12、10% FBS、1% penicillin/streptomy-cin、20ng/ml NGF;无血清限制性培养基包括Neu-robasal、2% B27、1% penicillin/streptomycin、20ng/ml NGF、2mmol/L L-glutamine.

　　1.2.3成年大鼠MPG神经元的分离细胞培养将每个神经节组织用显微剪剪成8-10小块.首先将组织块置入预热的1g/L胶原酶中37 ℃消化25min,用HBSS液漂洗2次,离 心1 000r/min,5min.然后将组织块置入预热的0.1%胰蛋白酶中消化30min.再加入血清培养基以中和胰蛋白酶,用玻璃吸管稍加吹打以使胰蛋白酶与培养基混匀.

　　1 000r/min离心5min后去除上清.重新加入无血清限制性培养基重悬细胞,用火焰刨光的玻璃吸管轻轻吹打10次.静置2min后,将上面细胞悬液转移到另一离心管.余下组织块多次重复上述过程,直至组织块基本消散为止.吹打过程中动作要轻,尽可能避免产生气泡.将全部细胞悬液1 000r/min离心5min,去除上清后加入少许无血清限制性培养基重悬.将细胞悬液种植到包被备用的培养皿中,细胞的接种密度约0.5×107个/L.将分离的细胞置入CO2培养箱中培养,2h后轻轻吸掉上清,少许无血清限制性培养基漂洗一次后再次加入新鲜培养基.培养细胞保持不动直至48h后进行全量换液,根据生长情况以后每2-3d半量换液一次,倒置显微镜下进行形态学观察,观察细胞形态变化及生长状况.

　　1.2.4成年大鼠MPG神经元的鉴定取培养6-10d左右的细胞进行免疫组织化学染色,用神经微丝(NF-200)单克隆抗体进行MPG神经元的鉴定.

　　免疫组化的步骤如下:

　　1)4%多聚甲醛室温条件下固定20min.

　　2)0.01mol/L PBS漂洗2min×3次.

　　3)滴加5% BSA封闭液,室温下作用20min.甩去多余液体,不洗.

　　4)加入一抗(1∶400小鼠抗NF-200单克隆抗体)4℃冰箱过夜.以仅加等量的抗体稀释液作为对照实验.

　　5)0.01mol/L PBS漂洗2min×3次.

　　6)加入二抗 (1∶100FITC标记山羊抗小鼠IgG)37℃孵育20min.以仅加等量的抗体稀释液作为对照实验.

　　7)0.01mol/L PBS漂洗5min×4次,封片后荧光显微镜下观察神经细胞形态.

　　2结果

　　2.1成年大鼠MPG神经元植块培养为了避免组织块漂浮导致植块培养失败,我们一般在72h后才开始观察组织块的生长情况.实验中发现绝大部分MPG植块在体外培养时均能生长良好.我们观察到72h后从植块周围逐渐生长出细小的神经突起,随着培养时间的延长神经突起从植块的四周呈放射状延伸(图1A-1B).经过10d左右的体外培养后,神经突起迅速生长,形成明显的神经突起晕.培养10d的MPG植块经免疫组化染色显示其发出的神经突起呈NF-200反应阳性(图1).

　　2.2成年大鼠MPG神经元分离细胞培养为了对成年大鼠的MPG神经元进行体外分离培养,我们参考成年大鼠海马神经元的培养方法并进行相关改进建立了成年大鼠MPG神经元的原代培养方法[2].本实验发现从成年大鼠能分离培养出生长状态良好的MPG神经元.图1C-1D显示了MPG神经元的光镜形态.我们观察到MPG神经元的胞体大小差异较大,胞体形态以卵圆形或梭状为主.原代培养的许多MPG神经元具有数个初级突起,甚至形成许多2级,3级突起.这些重新再生的突起具有大鼠周围神经元的典型形态,沿着神经突起上有许多膨大.

　　一些在体研究发现MPG神经元通常呈单个轴突,单个或无树突的形态[3],但是离体培 养中我们发现MPG神经元具有与在体不一样的形态特征.除了类似神经细胞的细胞形态外,还可以观察到星形胶质细胞、成纤维细胞等非神经细胞的形态.通常神经细胞生长在胶质细胞的上方,结合典型的神经元形态可以较容易的将两种细胞进行区别.

　　2.3成年大鼠MPG神经元的鉴定在体外细胞培养7-10d左右进行免疫组织化学染色,NF-200属于中间丝蛋白家族成员之一,为细胞骨架组分,主要分布于细胞核周及突起内,是神经细胞特异的蛋白,可用作神经元的分子标志物[4,5].NF-200抗体染色是神经元特异性染色,本实验中阳性细胞即为MPG神经元.NF-200阳性染色能清晰显示神经元的胞体及其突起形态,并且荧光主要位于核周及神经突起上(图1B,1D).

　　3讨论

　　神经细胞的体外培养从早期的植块培养发展到分离细胞培养，培养基从含血清发展到无血清。体外进行大鼠ＭＰＧ神经元的原代培养，ＭＰＧ的正确取材是技术难点之一。虽然胚胎或新生动物的神经细胞分化程度低，体外存活能力强，但是在前期预实验中均因ＭＰＧ体积较小，位置深在而无法进行满意摘取，所以我们考虑进行成年大鼠ＭＰＧ神经元的体外培养。本实验中MPG的取材均来自3个月左右的成年雄性大鼠,在熟悉大鼠MPG的准确解剖位置后,均能进行满意取材,而且细胞活力完全可满足培养的要求.

　　在MPG的植块培养过程中植块能否牢固贴壁是其培养成功与否的关键.前期实验中我们经常因植块脱离基质表面融合成单个团块或漂浮起来而导致培养失败.经过摸索,我们实验中作出如下改进增加植块的贴壁能力.首先我们利用Ⅰ型鼠尾胶原蛋白进行培养皿的包被,提高植块的贴壁能力.鼠尾胶原蛋白主要有以下作用:

　　①将神经植块锚定在种植的位置防止融合成单个的团块或漂浮.

　　②促进神经纤维的生长.另外早期培养基的量应以恰好淹没皿底保持植块湿润而不使其漂起为原则.最后植块静置的时间也十分重要,搁置过久就会影响神经元的活性,我们实验中一般静置时间约5min左右.Brewer在1997年对成年大鼠海马神经元的分离、纯化和长期培养进行了成功描述[2].我们参考海马神经元的原代培养方法,经过不断的摸索与改进成功进行了成年大鼠MPG神经元的分离与培养,培养的成年盆节神经元可存活2周左右.在进行成年大鼠神经元的分离培养时,酶消化过程可能是影响神经细胞活力最重要的步骤之一.

　　与胚鼠或新生鼠的神经元相比,成年神经元需要不同的酶进行消化以获得分散细胞.利用胶原酶、胰蛋白酶分步进行消化以及适当延长消化时间是成年大鼠MPG神经元成功进行体外分离培养的重要因素.我们观察到成年MPG神经元贴壁前的纯度很多程度上依赖于有效的蛋白酶消化.如果酶孵育时间过短或酶浓度偏低,就会因胶质细胞的比率过高而影响MPG神经元的存活.成年神经细胞与新生神经细胞相比突起长度更长,突起更加错综复杂[6].成年神经元的原代培养中需要更复杂的酶消化与分离步骤一定程度上反映了成年大鼠神经节细胞外基质的改变.

　　成年大鼠MPG神经元的分离过程中,神经细胞溶解死亡不可避免地产生细胞碎片.细胞碎片能降低培养基的pH值及释放细胞毒性物质,这些不利因素都将抑制神经细胞轴突及树突的生长和再生[7].此外,过多的细胞碎片也同时会影响细胞的贴壁.一般的处理细胞碎片的办法是进行漂洗,然而成年神经细胞的突起生长相对较缓慢,如果在神经细胞尚未完全贴壁时就进行漂洗将会明显降低神经元的产率.结合相关文献报道[8],我们在实验中观察到大部分MPG神经细胞在2h内均能进行贴壁,而未贴壁细胞则很难再贴壁存活.本实验中神经细胞培养2h后轻轻吸走培养基,用少许无血清限制性培养基漂洗一次,然后重新加入新鲜的培养基.这种方法能明显提高成年神经细胞的存活率.

　　如果在24h以后再更换培养基则神经细胞的数目会明显减少甚至未见神经细胞生长存活,这也充分说明了清除细胞碎片的重要性.

　　神经元的生长存活一定程度上依赖于靶器官或周围临近细胞所释放的神经生长因子.在成年动物的神经元培养中,神经因子能提高神经细胞的存活及突起生长.在众多神经营养因子中,研究 发现NGF能显着改善成年大鼠MPG神经元的存活,提高培养效果[9].本实验中也加入NGF来促进神经细胞的存活及突起生长.通过联合应用NGF,神经细胞的存活率及突起生长程度明显改善.

　　总之,我们利用相对较简单的培养条件根据上述2种培养方法成功进行了成年大鼠MPG神经元的体外培养,为今后对MPG神经元的进一步研究提供了重要基础.

　　参考文献

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