医学检验论文
肾穿刺活检是诊断肾脏疾病的重要手段。目前开展肾脏病理的医院寥寥无几。山东省交通医院自 2010 年 3 月与济南齐鲁医学检验所合作接收来自全省的肾穿刺活检远程邮寄病理检验标本以来，截至 2013 年12 月共接收3 216 例，前后选择 4 种固定液用于光镜标本的固定，对其染色结果进行比对分析如下。
1 材料与方法
1． 1 材料 2010 ～ 2013 年齐鲁医学检验中心收集的山东省内各医院肾内科的肾活检组织标本。
1． 2 主要试剂及仪器 10% 福尔马林: 40% 甲醛 10 ml + 90ml 蒸馏水。10% 中性缓冲福尔马林: 40% 甲醛 10 ml + 90 ml0. 01 mol / L PBS( pH 7. 2) 。PB-FA 固定液: 40% 甲醛 10 ml +纯乙醇70 ml + 20 ml 0. 01 mol/L PBS( pH 7. 2) 。Bouin 固定液: 苦味酸75 ml +40%甲醛25 ml + 冰乙酸5 ml。徕卡3500脱水机，HM315Ｒ 型 Microm 切片机，徕卡烤片机，恒温箱( 上海精密仪器厂) 。
1． 3 方法 将配好的固定液交给临床医师保存，2010 ～2012 年使用 10% 福尔马林，共 1 700 余例。2013 年开始使用 10%中性缓冲福尔马林，共 800 余例; 2013 年 10 月更换为 PB-FA 固定液，共 126 例; 2013 年 12 月试用 Bouin 固定液，截至目前共 278 例。除用 Bouin 固定液的组织在 70% 乙醇中脱水 1 h 以上，以洗去因固定液中苦味酸染上的黄色,其余均按常规方法脱水、石蜡包埋，每例 2 μm 厚连续切片10 张，行 HE、Masson、PAS 及六胺银常规染色，光镜下观察。
1． 4 评定标准 切片质量按优、良、差分为三等。评定标准具体如下: 优———折光率强、清晰，胞核、胞质着色分明，肾小球毛细血管壁、系膜细胞分明，色彩鲜艳，均匀一致，细胞无收缩; 良———细胞比较清晰，有轻度收缩，形态发生一定改变，核质着色分明; 差———细胞皱缩，皮髓质分界不清，核质着色不均。
2 结果
2． 1 眼观 肾活检组织放入 10% 福尔马林、10% 中性缓冲福尔马林及 PB-FA 固定液中，由于甲醛对红细胞有破坏，组织逐渐由红变成灰白色; 放入 Bouin 固定液中，肾组织立即由红色变为白色。
2． 2 染色 由 10% 福尔马林固定肾组织，HE 染色细胞核染色清晰，核质对比鲜明，但肾小球轻度收缩，舒展度不够( 图 1A) ; 10%中性缓冲福尔马林固定肾组织，HE 染色核染色不够鲜艳( 图 1B) ; PB-FA 固定液固定的肾组织，HE 染色细胞核着色困难，核质对比度较差( 图 1C) ; Bouin 固定液固定的肾组织，HE 染色色彩亮丽，对比清晰，组织结构分明( 图 1D) 。随机选取 4 种固定液固定的肾活检组织染色切片各 50 例，对其切片按优良差 3 个不同等级归纳( 表 1) ，结果显示，10%福尔马林固定肾组织所制 HE 切片的优良率为80% ，Masson 染色的优良率为 72% ; 10% 中性福尔马林固定肾组织所制 HE 切片的优良率为88%，Masson 染色的优良率为 74%; PB-FA 固定组织所制 HE 切片优良率为 72%，Mas-son 染色的优良率为 78% ; 而 Bouin 液固定肾组织所制 HE切片的优良率为 96%，Masson 染色的优良率为 94%。PAS及六胺银染色结果无明显差异，优良率为 95%左右。【表1】
3 讨论
适宜的固定液可使新鲜组织中的蛋白质沉淀，保持细胞内的成分和状态与生存时相仿，并使细胞内不同成分产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。本实验室长期以来选用 10% 福尔马林作为组织常规固定液，由于 10% 福尔马林偏酸性，而细胞核为酸性，嗜碱性增强，所制切片核染色清晰，色彩亮丽，但乙醇脱水后组织收缩明显，用于肾活检组织标本固定时肾小球出现皱缩，影响肾小球毛细血管壁及系膜细胞的观察。更换为 10% 中性福尔马林( pH 7． 2 ～7． 4) 后，正因为其 pH 值接近于中性，使 HE 切片核着色力下降，核质色彩对比度降低。后来参照余英豪等的方法，更换为 PB-FA 固定液，其特点是固定的组织收缩小，肾小管上皮固定良好，组织中的红细胞不被溶解，特殊染色色泽鲜艳，固定时间要求不超过 2 h 为佳，但本实验室接收来自全省的标本，固定时间较长，肾组织标本经 PB-FA 固定液固定后所制 HE 切片染色细胞核着色力度下降，胞质较红，色彩不鲜明，组织结构欠清晰，给诊断造成困难( 可能也有习惯的问题，诊断医师一直无法适应这种固定液固定的组织所做的 HE 切片) 。经过探讨及查找文献，改用 Bouin 液为固定液，Bouin 液是由甲醛、冰醋酸、饱和苦味酸溶液按 5 ∶ 1 ∶ 15 的比例配制，其中的冰醋酸对组织有一定的膨胀作用，从而中和了甲醛和苦味酸对组织的收缩，而苦味酸又具有助染作用，这可能是经 Bouin 液固定的组织 HE 染色在显微镜下的观察效果优于其它固定液标本的原因。
Masson 三色染色，主要用于区分胶原纤维和肌原纤维，在肾穿刺活检标本中用于显示肾小球沉淀的免疫复合物和基膜、系膜基质及胶原纤维等。由于肾小球组织结构特别精细复杂，加上病变部位变化极多，所以三色染色显示肾小球组织结构的变化要求准确、快捷、清晰。而本实验室通过外出学习及更换染色试剂等方法均无法使切片优良率提高，更换 Bouin 固定液后，由于其以苦味酸为主要溶剂、能迅速沉淀组织中的蛋白质，组织结构完整。Bouin 固定液固定的组织密度疏松，保持组织结构孔隙宽，渗透性高的特性，有利于丽春红、酸性品红、亮绿等大分子染料对组织的浸透。大量文献证实 Bouin 固定液更利于 Masson 染色，免疫复合物呈鲜红色沉积于基膜或系膜区，胶原纤维呈亮丽的绿色，肌纤维及红细胞呈红色。优良的切片染色对肾脏疾病的病理诊断具有重要作用。
HE 染色、Masson 三色、PAS 及六胺银染色是肾组织活检病理诊断的基础，而组织固定是蜡块制作过程的第一步也是最重要一步，直接关系染色的结果进而影响病理诊断结果。王海萍等等曾报道 Bouin 固定液固定睾丸组织的切片观察效果优于甲醛; 虽然在探讨肾活检组织固定液中，作者认为 Bouin 固定液所制切片质量最好，但由于我们所接受的肾穿刺活检组织一直留出一条新鲜组织做免疫荧光染色，不需要蜡块组织行免疫组化染色，不同固定液对免疫组化染色的影响，将是我们下一个研究目标。
参考文献:
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