医学遗传学论文
遗传病论文（行业热点范文8篇）之第八篇
摘要：应用高通量测序技术(HT-NGS,High throughput-next generation sequencing technologies)研究自然流产发生的遗传学病因分布情况。方法 提取孕早期流产绒毛组织或孕中期流产胎盘组织,裂解细胞后提取DNA。采用高通量测序技术检测染色体异常图谱。结果 共检测174例流产组织,诊断成功率100%。诊断正常核型110例,占63.2%,女男比例1:1.39。诊断染色体数目异常64例,占总病例的36.8%。其中45,X 14例,占数目异常的21.9%;21-三体10例,占数目异常的15.6%;16-三体、14-三体和22-三体各5例,分别占数目异常的7.8%;18-三体和13-三体各4例,分别占数目异常的6.3%;69,XXX、69,XXY及3-三体各2例,分别占数目异常的3.1%。诊断CNV81例,占46.6%。其中有临床意义的28例,占16.1%,无意义及意义不明的占30.5%;正常核型合并CNV58例,占CNV总数的71.6%,染色体数目异常合并CNV23例,占CNV总数的28.4%。其中1例患者检测到13号染色体大段缺失。174例组织中,早期妊娠135例,其中染色体数目异常61例,占早期妊娠病例的45.2%;检测46,XN 74例,占早期妊娠病例的54.8%。结论 高通量测序技术为发展的新技术,可用于任何孕期诊断。其取材量少,检测成功率高,快速、覆盖面广,但缺点是价格贵,对于平衡易位无法诊断。
关键词：自然流产,高通量测序,拷贝数变异
自然流产与遗传病因密切相关,应用遗传学方法检测流产组织的遗传学异常对于研究流产原因的具有重要意义。继G显带核型分析、荧光原位杂交技术应用于临床后,高通量基因测序技术研究和应用也日益受到重视,成为更有效的自然流产遗传病因检测方法。
1 资料与方法
1.1 研究对象来源
2013年1月-2014年12月期间的自然流产患者,除外父母已知染色体异常、免疫异常、夫妇血型不合、生殖器官畸形等可能引发自然流产的因素,收集流产组织共174例,应用HT-NGS分析流产组织标本。
1.2 取样及检测方法
按照相关操作技术规范取材。绒毛组织0.5g进行DNA提取后基因组片段化,经历扩增杂交后测序得到图像原始数据,芯片原始数据经过软件转换及计算,即可得到可视化的染色体异常图谱。
1.3 统计分析
数据资料录入Microsoft Office Excel 2010建立数据库。计量资料采用均数±标准差表示,对率的检验采用卡方检验。数据处理采用SPSS11.5统计软件,P<0.05表示具有显着性差异,P<0.01表示具有非常显着性差异。
2 结果
2.1 一般情况
本研究共入选174例患者,患者平均年龄2902±356岁,平均流产次数257±022次。
2.2 研究结果
完成174例标本检测,检测成功率100%。诊断正常核型110例,占63.2%。其中46,XX 46例,46,XY64例,流产胚胎女男比例为1:1.39。诊断染色体数目异常64例,占总病例的36.8%。
2.3 HT-NGS检测染色体数目异常
HT-NGS共诊断染色体数目异常64例,其中45,X诊断14例,占数目异常的21.9%;21-三体10例,占数目异常的15.6%;16-三体、14-三体和22-三体各5例,分别占数目异常的7.8%;18-三体和13-三体各4例,分别占数目异常的6.3%;69,XXX、69,XXY及3-三体各2例,分别占数目异常的3.1%;其余类型染色体数目异常各1例,分别占数目异常的1.6%;174例标本共诊断CNV81例,占病例总数的46.6%,包括正常核型合并CNV以及染色体数目异常合并CNV。其中正常核型合并CNV58例,占CNV总数的71.6%,染色体数目异常合并CNV23例,占CNV总数的28.4%。
3 讨论
本研究使用HT-NGS微珠芯片系统,对174例早、中期妊娠自然流产患者绒毛膜组织进行了全基因组染色体分析,对引起流产的染色体异常进行分析。在所有患者中发现染色体改变122例,其中染色体数目异常64例,CNV81例,染色体数目异常合并CNV23例。
随着现代分子生物学技术的不断发展飞跃,高通量测序(HT-NGS)技术时代已经到来。HT-NGS技术可以同时并且更准确地对23对染色体数目或结构异常进行诊断分辨率高[1] ,它可以准确地确定DNA每一个碱基的构成,远高于传统的检测方法,能发现容易漏检的微小片段的非平衡染色体易位、重复和缺失[2,3,4] 。HT-NGS诊断快,只需要2-3天,也有可能实现1天内完成检测。近来有报道单细胞微阵列分析时间可<10h,可以用于囊胚期胚胎植入前诊断,而不错过胚胎的种植窗,不影响患者当日新鲜移植[5,6] 。
HT-NGS的特点是针对所有DNA碱基序列的测序。因此,对于多病种、多位点的评估,HT-NGS技术将会显示出它强大的优势。基于改良的全基因组扩增技术,能够使待检的DNA样本扩增25万倍,仅需要极少的细胞就可以进行样本DNA的提取,避免了细胞培养失败造成的核型无法分析的情况。HT-NGS适应于患有染色体数目或结构异常的患者;复发性流产或不明原因流产的患者;生育过染色体异常患儿的夫妇;胚胎反复种植失败的夫妇。这些均可以引起胚胎的染色体非平衡状态或非整倍体,导致胚胎死亡、流产或者生育出染色体异常患儿。
有研究将其用于无创性产前诊断[7] ,对胎儿进行靶基因扫描,能更加精细地评估胎儿的健康状况。与传统的G显带染色体核型分析及FISH相比,HT-NGS能够敏感而准确地测出DNA双螺旋结构中每一个碱基对的组成,因此可以对所有已知的与未知的基因变异做出有效地检测。此外就所取材料上来看,传统细胞学技术要求标本必须为无菌且有活力的细胞,否则无法培养成功,而芯片方法,则是通过提取组织细胞的DNA,对无菌没有严格要求,且很少的组织即可通过扩增实现对标本的分析,这一优势也是细胞染色体核型分析技术无法比拟的。
在本研究中,HT-NGS检测出所有的标本,诊断成功率100%。染色体数目异常检测比较准确,部分地纠正了细胞学染色体检测的失误。同时,对FISH检测的局限性也是很好的补充。对于染色体结构异常,微小缺失和重复,都可以做出比较满意的诊断。获得了更高的结构异常检出率,主要包括200kb以上片段的重复和缺失。这是由于传统的绒毛组织培养-染色体核型分析方法只能检测10Mb以上片段的重复,缺失,无法检出微小的片段缺失和重复从而诊断为正常染色体。而高通量测序可以发现的细微结构异常,可以为临床提供更为准确的染色体异常信息,同时,还可以检测出CNV变化。
HT-NGS目前也存在相应问题,首先,不能检测出平衡易位。因此染色体核型分析联合CNVs检测是目前比较完善的诊断方法。本研究3例核型分析发现细胞水平的平衡易位,通过芯片检测后并未发现微缺失和微重复。其次,随着检测技术分辨率的提高,一些畸变的检出率也在提高,但同时也发现了大量的小片段的CNVs改变(<1MB),这些CNVs与疾病的关系难以解释。因此对所发现的CNVs的解释成为实验室诊断的最大挑战。从我们的实验数据得出的结论是没有准确的规律可循,人为评估十分必要。第三,目前所使用的基因芯片大多来自国外,试剂和仪器的价格昂贵,不利于其的大规模开展。
参考文献
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