LncRNAs对卵泡发育不同阶段的影响

　　摘    要：　长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸的RNA,没有编码蛋白质的功能,但是可以调控基因表达,并且参与细胞内多种生物功能的调控过程。目前的研究认为,LncRNAs可能通过调节卵丘的扩张和卵母细胞的成熟参与到卵泡发育的过程。因此,对LncRNAs和卵泡发育关系的深入研究有助于进一步了解卵泡发育的分子机制。现就LncRNAs在卵泡发育过程中的作用进行总结。

　　关键词：　长链非编码RNA; 卵母细胞; 卵泡发育;

　　Abstract：　Long non-coding RNAs(LncRNAs) are a type of RNA with a length greater than 200 nucleotides. It does not have the function of encoding proteins,but it can regulate gene expression and participate in the regulation process of various biological functions in cells. Current studies believe that LncRNAs may participate in follicle development by regulating cumulus expansion and oocyte maturation. In-depth study on the relationship between LncRNAs and follicle development will help to further understand the molecular mechanism of follicular development. The role of LncRNAs in follicle development is reviewed in this paper.

　　Keyword：　Long non-coding RNAs; Oocyte; Follicular development (J Reprod Med 2020,29(12):1677-1681);

　　长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸且无编码蛋白质功能的RNA。近年来,越来越多的研究表明,LncRNAs几乎在基因表达的每一个阶段都发挥了广泛的调节作用,这些调节作用包括信号转导、诱导分化等[1]。目前许多证据显示了LncRNAs在人类各种疾病中的重要性,并指出它们的失调和突变是一些疾病的基础[2]。LncRNAs不仅在感染、肿瘤和细胞凋亡等生物过程中起调控作用[3,4,5,6],而且具有作为治疗靶点和诊断标记物的潜力[7,8],且其在卵泡成熟、胚胎发育等生殖过程中的作用也在不断地被发现[9,10,11]。目前,已确定了大量与生殖相关的LncRNAs。Karlic等[12]使用二代测序和从头转录组装技术定义了由卵母细胞向胚胎转变过程(OET)中表达的1 600个LncRNAs的核心群体,解释了OET中已分化的配子转变为多能卵裂球及母体-受精卵RNA交换过程中涉及到的LncRNAs重塑。而卵泡发育过程本质上就是卵母细胞和周围的颗粒细胞及卵泡膜细胞相互之间的调控,LncRNAs可能参与其中。本文就LncRNAs对卵泡发育过程中不同阶段的影响进行了总结,为进一步研究LncRNAs在辅助生殖技术中的机制和作用提供理论基础。
 

　　一、LncRNAs影响生殖干细胞的增殖和发育

　　Li等[13]通过高通量测序研究了雄性和雌性小鼠生殖干细胞中mRNAs、LncRNAs和CircRNAs的表达谱,发现了18 573个新的LncRNAs和18 822个新的CircRNAs,并通过实时定量PCR进一步证实了这些新的LncRNAs和CircRNAs的存在,并且有8 115个mRNAs、3 996个LncRNAs和921个CircRNAs存在性别差异性表达,此研究还发现LncRNA Gm11851、LncRNA Gm12840、LncRNA 4930405O2 2Rik和LncRNA Atp10d等在小鼠生殖干细胞中存在性别差异,这表明LncRNAs可能参与生殖干细胞的调控及发育过程。

　　哺乳动物基因组转录的LncRNA生长停滞特异性转录本5(Gas5)在多种发育过程中起着重要的调控作用。Wang等[14]研究发现LncRNA Gas5在新生小鼠卵巢中高表达,并且定位于雌性生殖系干细胞(FGSCs)和卵母细胞,可促进FGSCs增殖、延长FGSCs在体外存活的时间、抑制体外培养中FGSCs的凋亡。所以我们可以认为LncRNA Gas5可能参与调控FGSCs生长及其向卵母细胞发育的过程。

　　Penkala等[15]从X染色体中鉴定出一个新的LncRNA,命名为LncRHOXF1,是一种长约1kb的剪接多聚腺苷酸,存在于体外分化的人滋养外胚祖细胞的胞核和胞浆中,在人类囊胚的滋养外胚层和原始内胚层细胞中大量表达,在缺乏LncRHOXF1 的人类胚胎干细胞中进行的功能获得性实验结果表明,LncRHOXF1抑制了胚胎干细胞增殖,而有利于其细胞的分化。

　　二、LncRNAs调节卵丘扩张和发育

　　卵丘细胞(CCs)在位置上比壁层颗粒细胞更靠近卵母细胞,对卵母细胞的成熟有极其重要的作用,主要体现在CCs参与了阻滞卵母细胞减数分裂、诱导卵母细胞减数分裂过程的恢复、支持卵母细胞质的成熟等过程[16]。并且有研究发现,CCs对卵母细胞和卵泡发育的同步性是至关重要的[17]。

　　Bouckenheimer等[11]利用转录组测序技术分析发现人卵母细胞周围的CCs可为卵母细胞运输大量的营养物质,包括 mRNA和LncRNAs,说明LncRNAs 可以通过CCs影响卵母细胞的成熟。后来Yerushalmi等[18]从体外成熟(IVM)患者的生发泡期卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中获得致密型的CCs,从试管受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)患者的中期(MII)COCs中获得扩张型的CCs,通过使用RNA测序技术获得样本的整体转录组图谱,从致密型和扩张型CCs中发现的差异表达基因多达1 746个,且大多与细胞增殖、细胞运动、细胞周期、细胞间信号传导和相互作用、细胞外基质和类固醇合成有关。差异表达的基因中包含89个LncRNAs,其中12个LncRNAs编码在已知的参与颗粒细胞生长发育进程的基因的内含子中,这表明LncRNAs可能参与卵丘扩张和卵母细胞成熟的调节。

　　Xu等[19]比较了3对可形成高质量胚胎的成熟卵母细胞的CCs(H-CCs)和可导致低质量胚胎的成熟卵母细胞的CCs(P-CCs)中LncRNA的表达谱,共有20 563个LncRNAs在人CCs中表达,与H-CCs比较,P-CCs中有124个LncRNAs持续上调,509个LncRNAs持续下调(折叠变化≥2.0,P<0.05),LncRNAs在P-CCs和H-CCs中的表达存在差异,提示LncRNAs可能通过调节卵丘细胞来参与卵母细胞的发育过程。

　　多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女无排卵性不孕的最常见原因之一,Huang等[20]首次用基因芯片技术确定了PCOS患者CCs的全基因组LncRNAs。研究者使用微阵列描述了10名志愿者(5名PCOS患者和5名正常女性)的CCs中的LncRNAs图谱,观察到623个LncRNAs和260个mRNAs表达显着上调或下调(≥2倍变化),选取其中5个差异表达的LncRNAs(XLOC_011402、ENST00000432431、ENST00000433673、ENST00000450294和ENST00000454271)进行实时定量PCR验证,结果与基因芯片结果一致。进一步的分析结果表明2号染色体转录了大量的差异表达的LncRNAs,有作为增强子来调节其邻近蛋白编码基因的可能性。这些结果表明,与正常妇女相比,PCOS患者CCs中的LncRNAs表达异常,这些差异可以用来区分PCOS患者和正常妇女的CCs。提示LncRNAs会影响卵母细胞的发育。

　　三、LncRNA参与颗粒细胞增殖、分化与凋亡

　　卵巢中的颗粒细胞(GC)的重要性不言而喻,从原始卵泡生长启动到增殖、分化,再到闭锁/排卵,直至最终黄体形成整个过程中,既有卵母细胞对GC增殖与分化的调控,也有GC对卵母细胞成熟的影响。

　　抗苗勒管激素(AMH)对以下细胞有作用:成年动物的卵巢颗粒细胞、睾丸间质细胞及睾丸支持细胞。AMH通过其AMH Ⅱ型受体(Amhr2)实现其特异性的作用,但目前研究尚未明晰Amhr2基因被特异性激活机制。Kimura等[21]在睾丸支持细胞与卵巢颗粒细胞中发现了一个从Amhr2基因上游转录而来的LncRNA,LncRNA-Amhr2,分析得出LncRNA-Amhr2激活可提高Amhr2启动子活性。在小鼠颗粒细胞OV3121细胞中,Tet-on系统诱导的 LncRNA-Amhr2转录可显着提高Amhr2启动子的活性。以上研究可知,通过增强启动子活性,LncRNA-Amhr2在卵巢颗粒细胞Amhr2基因的激活中发挥作用。

　　脯氨酰寡肽酶(POP)是一种多功能蛋白酶,参与多种生理活动,为了鉴定POP基因新的调控元件,Matsubara等[22]比较了人类和小鼠POP基因的序列,在基因间隔区相邻处找到了6个保守非编码序列(CNS),有4个LncRNAs是从位于小鼠POP基因的CNS转录的,其中一个LncRNA(LncPrep+96kb)的表达模式与POP基因的表达模式相关。研究者在原代卵巢GC和肝细胞系中将LncPrep+96kb敲除,这两种细胞中POP的mRNA表达水平都降低了,但过表达LncPrep+96kb,只增加GC中POP mRNA的表达。由于LncPrep+96kb在激素处理的卵巢中上调的时间与POP的时间相同,说明LncPrep+96kb可能在GC的POP基因激活中发挥作用。

　　Liu等[23]研究了LncRNAs在PCOS发病机制中的潜在作用。通过微阵列比较了7名PCOS患者和7名正常女性GC中的LncRNAs表达谱,采用实时定量PCR检测了53例PCOS患者和50例对照组GC中LncRNA HCG26的表达水平,并敲除了KGN细胞中的HCG26基因,观察其对细胞增殖、芳香化酶和卵泡刺激素受体基因表达以及雌二醇产生的影响。与对照组相比,PCOS患者 GC中共有862个LncRNAs转录本和998个信使RNA转录本差异表达(P<0.05)。PCOS患者HCG26水平升高,并与窦卵泡计数相关。KGN细胞敲除了HCG26基因后,细胞增殖和细胞周期进程受到抑制,芳香化酶基因的表达和雌二醇的产生增加,提示失调的LncRNAs可能在GC增殖和类固醇生成中起重要作用。

　　卵巢早衰(POF)是一种典型的老年女性生殖系统病理性疾病。感染、炎症、免疫异常、基因突变、放疗和化疗均可引起POF。卵巢颗粒细胞(OGC)功能障碍直接影响卵巢早衰的发生。Liu等[24]发现雷公藤多甙可通过促进p53磷酸化和激活丝氨酸/苏氨酸激酶11-p53-p21信号通路诱导大鼠卵巢早衰。Xiong等[25]进行的一项体内实验发现环磷酰胺可导致小鼠卵巢萎缩、抑制OGC增殖。环磷酰胺处理组的p53、p66Shc和p16的蛋白表达水平显着增高。Northern blot杂交结果显示,环磷酰胺处理组的LncRNA-Meg3杂交信号强度显着高于对照组。芯片结果证实,经环磷酰胺处理的OGC的 p66Shc启动子DNA片段显着增加,且富含p53蛋白。这个实验说明,环磷酰胺可以通过激活LncRNA-Meg3-p53-p66Shc通路促进卵巢早衰、抑制OGCs增殖,也说明可能存在LncRNAs对GC内部调控的机制。

　　四、LncRNAs调控卵母细胞核与细胞质的成熟

　　卵母细胞成熟过程包括细胞核与细胞质的成熟。细胞核成熟包括染色体复制过程、生发泡破裂过程、同源染色体分离过程等。而细胞质的成熟又分为细胞器的形态成熟过程、卵母细胞骨架成熟过程以及成熟过程中需要的RNA转录与蛋白质合成等。付蕾等[26]的研究表明卵母细胞成熟率低可能影响受精及胚胎发育,导致可供移植的胚胎数减少,妊娠率下降。

　　Huang等[27]通过实时定量PCR方法检测卵丘细胞中PWRN2的表达水平,以确定其在PCOS患者的卵母细胞核成熟过程中的潜在作用。发现在PCOS患者的卵母细胞成熟过程中,LncRNA PWNR2通过减少miR-92b-3p与TMEM120B靶结合的可能性,进而在PCOS患者的卵母细胞核成熟过程中发挥重要作用。

　　Karlic等[12]研究发现,LncRNAs对卵母细胞的成熟过程产生了非常大的影响,当mRNA在卵母细胞内发挥转录功能、调控细胞质聚腺苷酸化时,卵母细胞内处于休眠状态的LncRNAs会被激活,在促进细胞质聚腺苷酸化的过程中与mRNA起到协同作用,所以LncRNAs在调控卵母细胞成熟特别是胞质成熟过程中可能会发挥重要的作用。Bouckenheimer等[11]对公开的RNA测序数据进行了分析,发现在中期(MII)卵母细胞和CCs中有丰富的LncRNAs,例如:C3orf56、BCAR4、Tunar、OOEP-AS1、CASC18和LINC01118存在于MII卵母细胞,MALAT1、NEAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1和VIM-AS1存在于CCs。该研究还发现MII卵母细胞中的LncRNAs可能参与了染色质重塑和胞质成熟。

　　五、LncRNAs参与排卵和黄体形成

　　Neat1是一种长链非编码RNA,它是paraspeckles核体的架构组件之一。研究发现,排卵正常的小鼠在Neat1基因敲除后不能怀孕,而且Neat1在黄体中高表达,近一半的Neat1基因敲除小鼠黄体组织的形成严重受损,说明Neat1对于黄体的形成至关重要[28]。

　　李加宇等[29]研究找到了3个在小鼠卵巢中具有相对特异性高表达的LncRNAs(LncRNA147、LncRNA274和LncRNA647),而且LncRNA647、LncRNA147和LncRNA274在不同卵巢状态下的表达丰度存在差异。分别检测了这3个LncRNAs在小鼠不同发育时期和不同发情时期卵巢中的表达水平,不同发育期分别是5日龄、3周龄、5周龄、8周龄,不同的发情时期包括发情间期、发情前期、发情期和发情后期。结果显示LncRNA147和LncRNA 274在8周龄小鼠卵巢中的表达水平达到最高,在其它3个发育阶段卵巢中的表达水平由5日龄、5周龄和3周龄依次递减;LncRNA647较高表达水平出现在5周龄和8周龄卵巢中,5日龄和3周龄卵巢中的表达水平依次降低;在不同发情时期的卵巢中,3个LncRNAs的表达水平均按发情间期、发情前期、发情期和发情后期的顺序逐渐升高,而发情后期的表达水平显着高于其它3个发情时期。体内转染LncRNA274基因后,与对照组相比较,卵泡发育相关基因LHR升高了约18倍,FSHR的表达水平升高了约7倍,BMP-15升高了约7.5倍,EGFR升高了约7.5倍,GDF-9升高了约11倍;黄体的数量(13.3±4.9)显着增加(P<0.05),而腔前卵泡、有腔卵泡数量没有显着变化。构建LncRNA274转基因小鼠并进行表型分析,发现小鼠产仔数显着增加,结果具有统计学意义。上述结果表明LncRNAs可促进黄体形成和排卵。

　　六、LncRNA与卵巢发育

　　β晶体蛋白B2(CRYBB2)基因敲除小鼠的卵巢出现形态和功能异常。Gao等[30]对野生型和CRYBB2基因敲除小鼠的卵巢组织进行了LncRNA和mRNA微阵列分析。野生型和CRYBB2基因敲除小鼠卵巢组织间有157个差异表达的LncRNAs和1 085个差异表达的mRNAs。实时定量PCR证实,在CRYBB2基因敲除小鼠的卵巢组织中,LncRNA A-30-P010 19163的表达下调,配体门控离子通道7(P2rx7)的表达相应下调。综上所述,CRYBB2调控不同的LncRNAs的表达,从而影响卵巢的发育,LncRNA A-30-P01019163可能通过调节卵巢P2rx7的表达而影响卵巢发育。

　　研究卵母细胞质量的重要意义之一是提高卵母细胞体外成熟的临床效果,所有提高卵母细胞质量的方法都能用于提高临床体外成熟卵母细胞的妊娠率,进而为不孕症的治疗带来新的可能性。现在科学研究在不断探索和发现LncRNAs的作用及机制,在卵泡发育、卵母细胞成熟以及早期胚胎发育过程之中,已经有研究成果逐步证实了LncRNAs的调控功能。希望在不远的将来,可以通过检测LncRNAs直接预测卵母细胞的成熟状态,从而为卵子受精和胚胎发育提供更有力的技术支持,推进生殖技术的进一步发展。

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