现代遗传学/基因组学在生殖医学范畴的发展

　　改善生殖健康和降低出生缺陷问题，是21世纪生殖医学领域的重要使命。根据中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2012年9月 《中国出生缺陷防治报告》发布的数据，中国2011年出生缺陷的发生率为5.6%，每年新增病例90万。发病率较发达国家高出近2倍，每年国家和社会的经济负担高达数千亿元。其中遗传性病因约占40%~60%，这还不包括遗传性功能缺陷（即广义的出生缺陷），如遗传性耳聋、智障、孤独症等。

　　在生育障碍的一系列研究中，人们对女性和男性配子以及胚胎的发育和调控机制表示了极大的关注，其遗传性状的影响主要表现在：①配子发生障碍，表现为卵母细胞和精子的数量减少、质量低下和功能缺陷等。②机体对外界的环境因素更为易感，出现生育能力低下和妊娠丢失。③子代的生育风险加大。

　　排在前位的出生缺陷和生育障碍，几乎都属于复杂性疾病，也就是由多个致病或易感因素与环境交互作用产生的遗传物质的结构和功能异常。目前对这类疾病的发病机制和遗传规律所知甚少，采用传统的常规技术无法对人群和患者进行高效便捷的遗传学诊断和筛查。因为人口众多、地区发展的不平衡，对于已出生的缺陷患儿，尚缺乏系统的干预和纠治策略以及长效机制，构成目前面临的知识瓶颈、技术瓶颈和体制瓶颈的严峻形势。

　　人类基因组计划（human genome project，HGP）的提前完成 ，敲开了基因组医学的大门。

　　透过这扇门，人们看到了更为广阔的全新基因组医学领域，意味着后基因组时代的到来。人类变异基因组计划、全基因组关联研究 （genome-wide associationstudies，GWAS）及重要疾病基因组学，以及其他组学等全景式分子医药工程技术的发展，为21世纪新的医学模式———个体化医学奠定了基础。近年来，由于对人类基因组的不断解析，特别是应运而生的分子生物检测技术和全基因组分析的核心技术———微阵列生物芯片和深度测序技术的问世，使得我们真正地走进了以基因组医学为基础的个体化医学时代。本文重点讨论现代遗传学/基因组学在生殖医学领域的发展。

　　1 后基因组时代的技术发展

　　人类基因组学已揭示出每个人的遗传背景是有差异的，构成人体遗传图谱共30亿个核苷酸分子，其遗传图谱字母排列的99.9%是相同的，但剩下的0.1%的差别（变异）是至关重要的，这些变异称为基因多态性，其中最为重要、最常见的为单个核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），是继限制性片段长度多态性（RFLP）、短串联重复序列（STR）之后的第3代遗传学标记，是功能基因组学、疾病基因组学、药物基因组学和环境基因组学重要研究内容。GWAS利用分析标签SNPs（tagging SNPs，tSNPs），检测人类基因组中大多数常见的SNPs，目的是识别人类全基因组中可能与复杂疾病相关联的变异，截止2013年底，已有超过1 605个GWAS研究检测基因与150多种人类疾病存在相关性，发现数千个与疾病有关联的SNP。

　　高通量测序是指一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，泛称为二代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS）。该技术可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，又称为深度测序。

　　目前深度测序技术呈风起云涌般发展，已经深入到基础和临床遗传学的各个方面，大有后来居上的势头。分子生物检测技术的飞速发展，为基因芯片、二代测序等高通量全基因组分析技术（genomicprofiling）的应用提供了强大、有力的技术平台，使得10多年前举全世界之力、耗资数十亿美元才完成的人类全基因组测序，现在可以在1周之内、花费数千美元即可完成，从而实现了一些罕见性遗传相关疾病的病因确诊。

　　利用新一代深度测序技术完成的全基因组、全外显子组捕获、高通量靶向基因的测序，以及RNA-Seq、microRNA表达谱等，对新型的以基因组医学为基础的个体化诊断医疗预防之医学模式提出了全新的挑战和革命。通过新一代测序技术检测母血中的游离胎儿DNA（cffDNA）进行无创产前诊断已成为近年来产前诊断的新趋势，且越来越多地被用于临床。2012年Kitzman等完成对cffDNA的全基因组测序，使得单基因疾病的无创诊断和筛查的临床应用指日可待。

　　随着技术的飞跃进步及检测成本的不断降低，科学家们提出的1 000美元的基因组检测目标有望在未来几年内实现，使得个人基因组信息有可能在不远的将来走进临床，指导疾病的诊断、治疗和预防。

　　2 基因组分析技术在生殖医学领域的应用

　　人类遗传通过生殖繁衍来完成，和生殖直接相关的疾病更是与遗传、变异密切相关。以往对生殖疾病的遗传易感因素的研究多是基于假说的候选基因的研究，近年随着生物医学技术的不断发展，生殖领域迅速地进入了后基因组时代的应用领域，力求发现基因组中可能与复杂疾病相关联的变异。

　　围绕着对人卵母细胞和早期胚胎的基因组研究、多囊卵巢综合征（PCOS）、卵巢早衰（POF）/原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）、男性无精症、子宫内膜异位症（EMs），以及胚胎植入前遗传学诊断（PGD）等生殖医学领域的重大热点和难点问题展开，中国的科研成果也进入了世界前沿的遗传学/基因组学在生殖医学领域研究和发展的行列。

　　2.1 人卵母细胞和早期胚胎的基因组研究 基因组分析技术已成功地应用于对人卵母细胞和早期胚胎发育的研究，国内学者们已在世界着名科学杂志发表了具有国际影响力的研究成果。北京大学乔杰、汤富酬和谢晓亮研究小组完成了对人单个卵母细胞的高精度全基因组测序，通过分析卵母细胞的两个极体细胞推断获得卵母细胞本身的全部基因组信息。

　　该技术能够准确地推断出卵母细胞中基因组的完整性以及携带的遗传性致病基因的情况，从而选择出一个正常的、没有遗传缺陷的胚胎用于胚胎移植。

　　该技术用于胚胎植入前PGD，能有效地减少母源性先天性遗传缺陷婴儿的出生。

　　上海同济大学和南京医科大学生殖医学国家重点实验室薛志刚、范国平、刘嘉茵团队利用单细胞RNA测序技术，全面分析了鼠、人类卵母细胞以及早期胚胎不同发育阶段基因转录组的动态变化。

　　发现胚胎早期发育各阶段中均存在父亲或母亲来源的单等位基因表达差异；胚胎早期发育各阶段中的细胞周期、基因调控、蛋白质翻译以及代谢通路的基因转录变化以逐步启动的方式依序发生，胚胎早期发育由阶段特异的关键枢纽基因驱动。这些研究结果阐明了哺乳动物早期胚胎不同发育阶段转录组表达的特点，对于探讨哺乳动物胚胎发育机制、对人类胎源性疾病的临床诊断、预防、治疗均具有重要意义。

　　2.2 PCOS的遗传学研究 PCOS在育龄妇女中发病率约6%~8%，是不孕妇女的常见疾病，属于和遗传相关的复杂性疾病，涉及多个基因变异。而不良的宫内环境、生活方式和环境因素更增加患病风险，其一级亲属的再发病风险甚至高达20%~40%。早期对PCOS的遗传学研究，发现了至少100多种基因可能与PCOS的发病相关，但这些结果的重复性和可靠性尚存在争议。

　　山东大学陈子江团队进行了对PCOS的首个GWAS研究，该研究通过对744例PCOS患者和895例正常对照的全基因组芯片扫描分析，确定了2p16.3（rs13405728）、2p21（rs13429458）和9q33.3（rs2479106）3个位点与PCOS关联，这3个位点分别对应的是LHCGR、THADA及DENND1A基因。该研究团队的后续GWAS研究，进一步分析了中国汉族的1 510 例PCOS患者和2 016例正常对照者的数据。

　　该研究除了证实首篇GWAS报道的3个位点，又确定了8 个新的 PCOS 的关联位 点 ：9q22.32，11q22.1，12q13.2，12q14.3，16q12.1，19p13.3，20q13.2 和 2p16.3。筛选出的这些候选基因集中在与胰岛素、性激素和Ⅱ型糖尿病（T2DM）相关的通路上，与PCOS的病理生理学机制密切相关，这2项GWAS结果为PCOS的遗传学/基因组学基础研究提供了新的方向。

　　2.3 POF/POI的遗传学研究 POF通常是指女性40岁之前闭经，伴有高卵泡刺激素和低雌激素水平。大约1%的育龄妇女患有此病，是一类临床高度异质、病因复杂的疾病。由于POF的概念常代表卵巢功能的终末阶段，且无法体现疾病的进展性和多样性，美国生殖医学会建议称为POI，不但对该病给予了更准确的诠释，而且进一步揭示了疾病的本质特征。

　　卵巢发育需要许多基因通过多种途径发挥作用并相互协调，这些基因广泛分布于X染色体和常染色体，不同基因的突变可能通过累积效应或级联反应导致卵巢功能的完全丧失，尤其是那些与卵母细胞发生相关的基因，包括减数分裂基因，很可能与POF/POI的病因相关，但许多通过动物模型发现的候选基因在人体中的作用一直未得到证实。最近，国际权威期刊《新英格兰医学杂志》同期发表了2篇独立的原创性研究，首次在中国人和欧洲人的POI/POF不同家系中各自发现了减数分裂基因（HFM1和STAG3）的突变导致POF/POI。这个经历了10多年的假说，终于在小鼠动物模型和POI/POF病患中都得到了证实，为探索POF/POI的发生机制以及阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。

　　2.4 男性精子发生基因的遗传学研究 在10多年的前期工作中，南京医科大学生殖医学国家重点实验室应用基因组学技术，首次发现和验证了一批与精子发生相关的基因，继后又用蛋白质组学技术构建了一系列精子发生相关的蛋白质表达谱，包括：①小鼠睾丸单倍体生精细胞（精子细胞/精子）蛋白质表达谱，共2 116种蛋白可能参与了精子细胞的变态过程。②小鼠睾丸四倍体生精细胞（精母细胞）蛋白质表达谱，共3 507种蛋白可能参与了精母细胞的减数分裂过程。③人类睾丸蛋白质表达谱，其中2 873种蛋白可能与人睾丸的功能相关。这些研究证实了大量睾丸特异性基因编码蛋白质的存在，包括许多已经报道的与精子发生一系列生物学事件相关的蛋白质以及一系列未被深入研究的蛋白质，为精子发生调控蛋白的深入研究创造了条件。

　　近年来Hu等在构建了2 927例非阻塞性无精子症的患者和5 734例可育男性对照标本库的基础上，通过对1 000例无精子症患者外周血DNA与1 703例对照可育男性外周血DNA进行分析，发现32个SNP与无精子症高度相关，用GWAS方法分析了无精子症患者和正常男性外周血DNA的SNP位点变化，通过SNP与无精子症全基因组关联分析，确定了3个SNP位点与精子发生高度相关，分别为rs2477686、rs12097821和rs10842262。其中rs2477686所在区域有一个基因PEX10，已在果蝇中被证实该基因缺失可导致精子发生障碍和雄性不育，PEX10可能是人类无精子症的重要候选基因。

　　这些SNP位点的变化可能通过改变关联基因的表达而调控精子的发生，据此有可能发现新的精子发生调控基因，对揭示精子发生的调控机制和男性不育的诊治具有重要意义。

　　2.5 EMs的遗传学研究EMs是另一种导致女性生育力及生活质量降低的常见疾病，病因涉及到免疫学、解剖学、内分泌学等方面，一直缺乏及时和非侵入性的诊断工具，以及缺少真正有效的治疗手段，是目前EMs在临床上的最大障碍。双胞胎研究与家族研究已经证明遗传因素可增加患病相对风险。

　　Uno等开展了针对EMs的GWAS研究，这也是生殖领 域 的 首 个 GWAS 研 究 。 该 研 究 发 现 了9p21.3，8p23.1，1p36.12三个EMs相关区域，对应CDKN2B-AS1、DEFA10P-DEFA1，WNT4-ZBTB40基因。近年来又有了4项新的有关该病的GWAS研究，而最有影响力的是Albertsen等进行的两个阶段的大样本的全基因组关联队列研究，包括2 019例手术。。

　　证实的EMs病例和14 471例正常对照的SNP，发现1p36.12，2q23.3，6p22.3，10q11.21 等 区 域 和 EMs 相关，与之相关的是WNT4，RND3，RBM43，RNF144B-ID4，HNRNPA3P1等基因。这些研究结果表明遗传因素对EMs的发病有重要作用，相关的SNP位点有可能成为早期诊断EMs的生物标记。

　　2.6 PGD PGD/胚胎植入前遗传学筛查（PGS）是在胚胎期进行卵裂球或滋养细胞的遗传学检测，可以帮助有遗传病生育风险夫妇怀上正常胎儿，避免女方反复流产或终止有遗传缺陷的妊娠带来的身心伤 害。 荧 光 原 位 杂 交 技 术 （fluorescent in situhybridization，FISH） 曾是染色体异常PGD/PGS的主要技术方法，但是临床应用中存在诸多局限性，也限制了其在PGD/PGS中的进一步应用。近期微阵列比 较 基 因 组 杂 交 技 术 （array based comparativegenomic hybridization，CGH array）和微阵列单核苷酸多态技术（SNP array）具有高通量、快速、自动化等特点，可以全面检测整个染色体组的数目异常和微结构异常，已开始应用于临床PGD/PGS，明显提高了临床妊娠率。随着高通量遗传检测技术的飞速发展，新一代测序技术迅速从科研实验室走向临床应用，在染色体异常PGD中的应用具有更高通量、低成本的优势，并且可能应用于单基因病PGD，具有巨大的应用前景。

　　3 展望

　　生殖医学在过去的30多年经过了一个长足发展的过程，辅助生殖技术解决了很多不孕夫妇的生育问题，但仍有许多困难的病例和令人困惑的个体差异问题无法解决。

　　人们开始寻求优化的卵母细胞利用率最高的个体化诱导排卵方案，结合药物遗传学和药物基因组学研究结果，有可能成为指导个体化医疗的未来趋势，实现个体选择合适、有效、安全的诱导排卵治疗药物，降低卵巢过度刺激综合征（OHSS）风险，减少IVF的取消率，提高治疗过程的舒适度及接受度的最终目标；对人类早期生殖活动的遗传学规律的研究，使人们更多了解自然和环境对人类生存和繁衍的调控，制定更好的优生优育的生殖健康计划；人们将更加关注辅助生殖技术对配子和胚胎表观遗传学的影响，观察人工助孕技术对子代安全性的关系；这些都将会依赖后基因组时代的各类新型技术的应用，以进一步的深入研究和指导临床。

　　未来的以基因组医学为基础的个体化医学时代，包括遗传学/基因组学以及其他组学等在生殖医学领域的研究和发展，都需要全球性的合作，避免小样本的偏差及不同人种的易感基因位点的遗漏。

　　研究选择的样本需指定疾病亚型分型，以便找寻与亚型相关的可靠的遗传标记。随着后基因组时代科学技术的迅猛发展和快速进步，人类遗传学/基因组学以及其他组学的研究成果将“井喷”样地涌现，生殖医学的进步也将随之实现从量变到质变的飞越。