新疆人ACE，ApoE以及HLA-DRB基因多态性与长寿的关系

　　国际自然医学会将新疆和田地区列为世界四大长寿区之一，和田的长寿人群称之为自然长寿人群。

　　这一特殊人群为鉴定长寿的相关基因、 研究遗传因素与长寿的关系提供了一个理想的模型。研究表明，除了健康生活方式和良好饮食习惯外， 基因差异可能也是长寿的影响因素之一。 长寿一般都无一导致大多数成年人死亡的主要疾病，例如心血管病、糖尿病、老年痴呆症和癌症等，这为我们寻找与长寿相关基因提供了线索。 本研究旨在探讨新疆和田地区维吾尔族自然长寿人群中 ACE，ApoE 以 及HLA-DRB 基 因多态性与长寿的影响及相互关系 ，报告如下。

　　对象与方法

　　一、一般资料

　　选择新疆和田地区≥90 岁的维吾尔族自然长寿老人 144 例（长寿组），平均年龄 95.53 岁；选择同地区，年龄 60~70 岁者 69 例为老年组，平均年龄为66.71 岁；选择以同一地区彼此无血缘关系的已自然死亡的 61~73 岁者 52 例 （家族史中无寿命大于80 岁者）为对照组，平均年龄为 67.60 岁。

　　年龄标准：人寿保险公司提供百岁老人名单；逐村逐户走访，以四代人为基础；按 4 次重大历史事件（1902 年第 1 次鼠疫大流行事件；1912～1913年第 2 次鼠疫发生；1936 年回民战争；1952 年土地改革） 推定年龄， 一般为 6 岁无记忆，12 岁开始记忆，结婚年龄为≥15 岁，能参军打仗年龄为≥18 岁。

　　按此基本知识推断再与 1981 年户籍对照， 误差≤5岁；三查三对，不同的医师进行核对，不得出现矛盾；实际年龄参考公式=0.45×(自报年龄)十 50，实际年龄和自报年龄误差不超过 3 岁。

　　二、方法

　　1. 人基因组 DNA 提取： 在知情同意的前提下，抽取静脉血 5 ml，EDTA 抗凝， 低渗法破红细胞，分离白细胞，基因组 DNA 采用酚/氯仿抽提的方法，纯度为 A260：A280≥1.8。

　　2. PCR-SSP 法 扩增 HLA-DRB 等 位基因 ：PCR反应体系： 在 0.5 ml Ep 管中依次加入以下试剂，dNTP 1 μl，10×缓冲液 2.5 μl，DNA 聚合酶(上海复华生物技术有限公司提供)0.5 U， 消毒去离子水 16.5μl，5’引物及 3’引物各 1 μl，模板 DNA 1 μl 用石蜡油覆盖，离心混匀，进行扩增，取 PCR 产物 10 μl 电泳，于紫外灯下观察。

　　3. ACE 基因多态性检测 ： 目的片断扩增参照Rigat的方法设计一对引物，PCR 反应终末体积为 25 μl （其中包括模板 DNA 1 μl， 两种引物分别为 2 pmol，MgCl2终浓度为 2 mmol/L，KCl 终浓度为50 mmol/L，Tris-HCl 终浓度为 10 mmol/L （pH 8.0），Taq 酶 0.5 U）进行扩增 ，取 PCR 扩 增产物 10 μl 电泳，于紫外灯下观察结果，根据扩增片段长度确定其基因型别。

　　4. 单链构象多态性（SSCP）分析：取 PCR 扩增产物，经变性后电泳，硝酸银染色分析电泳结果。 将不同带型标本测序，确定变异碱基及其位置（测序由北京华大中生科技公司完成）。

　　5. ApoE 基因型检测：参考文献[3]设计合成一对引物 （由上海生工合成）。 PCR 反应终末体积为 25μl，采用美国 PTC-100 型 PCR 扩增仪进行扩增。 取PCR 产 物 10 μl 加 10 U Hha I 内 切酶 ，37 ℃酶 切 3h。 用 8%聚丙烯酰胺凝胶于 200 V 恒压下垂直电泳3 h，银染 ，据获得的 6 种 酶切图谱 ，判断 apoE 基 因型。

　　三、统计学方法

　　应用 SPSS 17.0 统计软件。各基因型频率采用直接计数法。 基因频率=阳性基因数/样本数×2 （而HLA-DRB51, DR52, DR53阳性率=阳性基因数/样本数）。 研究对象是否符合 Hardy-Weinberg 平衡用掊2检验；HLA-DRB、ACE 基因 I/D 多态性及 ApoE 基因分布，3 组间基因型及等位基因频率比较用 R×C 表掊2检验。

　　结 果

　　一、临床特点

　　本研究中患者均详细询问病史、 查体及行实验室检查；测量身高、体重、血压。实验室检查包括测定血胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和血糖水平。 结果显示， 长寿组与老年组体质指数（BMI）间比较其差异有统计学意义（P < 0.01），长寿组和老年组之间收缩压和舒张压的比较差异有统计学意义（P < 0.05）；长寿组与对照组间收缩压的比较差异有统计学意义（P < 0.01）；3 组间低密度脂蛋白比较差异有统计学意义（P 均<0.05），见表 1。

　　二、HLA 基因型的频率分布

　　长寿组 HLA-DR1，DR6（14）基因频率较对照组升高（P ＜ 0.05），与老年组比较差异无统计学意义；长寿组 HLA-DR9 频率较对照组降低（P ＜ 0.05），较老年组显著降低（P ＜ 0.01）；长寿组 HLA-DR51 基因频率较老年组降低（P ＜ 0.05），与对照组比较差异无统计学意义。 其余各型基因频率 3 组间比较差异无统计学意义（表 2）。

　　三、ACE 基因型和等位基因频率的分布

　　长寿组 D/D 基因型频率较对照组显著升高（P <0.01），与老年组比较也有显著升高（P < 0.05）；长寿组 D 等位基因频率亦显著高于对照组 （P < 0.05），与老年组比较差异无统计学意义； 另外，3 组间 DI、Ⅱ基因型比较其差异均无统计学意义，见表 3。

　　四、ApoE 基因型和等位基因频率的分布

　　ApoE 基因有 6 种不同的基因型。 长寿组 ε3/3基因型频率较老年组升高（P < 0.05），与对照组比较无明显差异；长寿组 ε4/3 基因型频率较对照组明显降低（P < 0.001），较老年组也显著降低（P < 0.01）；余基因型比较其差异无统计学意义。 大样本群体调查发现 ApoE 基因型及等位基因频率分布存在明显种族差异。 该研究结果显示，ε3/3 基因型也是维吾尔族的主要基因型，而 ε3 等位基因频率介于白人和汉族人之间，表现出微弱种族差异性，见表 4。

　　讨 论人类白细胞抗原 （human leukocyte antigen,HLA）是人类基因组的一个重要组成部分，蕴藏着丰富的遗传信息，与机体免疫，疾病与肿瘤的发生、发展有密切的关系。 本次研究中， 长寿组 HLA-DR1，DR6（14）基因频率高于对照组，而 HLA-DR9，DR51基因频率明显低于老年组，考虑 HLA-DR1、DR6（14）基因可能是长寿有利基因， 而 HLA-DR9，DR51基因可能是长寿的危险因素。 Takata 等于 20 世纪 90 年代检测了日本著名的长寿宫 82 例百岁老人 （100~106岁）、20 例长寿老人（90~99 岁），其对照组为 159 例同一地区的成年人， 并各组分析了 HLA 基因频率。

　　结果为百岁老人组 HLA-DRw9 基因频率为 8.5％，长寿组为 5.0％，而对照组则为 30.8％。 在 HLA- DR1出现频率又有不同，百岁老人 6％，长寿老人 10％，而对照组<0.63％。故提出 HLA 是决定人类寿命基因之一。 Henon 等研究了 336 例百岁以上退伍老兵和102 例 90 岁以上的随机选自家庭的长寿老人，得出HLA-DR11分子的保护效应，充分地表现了免疫易感基因优势， 有力地证明了 HLA-DR11基因的长寿效应。 Akisaka 等报道 HLA-DR9 在日本冲绳百岁老人中的频率很低， 是长寿的危险因素，HLA-DR1则表现很高的频率而被认为是有利因素。 Lio 等对撒丁岛地区 120 例长寿老人和 86 例当地对照组进行研究，未发现 HLA-DRB1 各等位基因频率间存在明显差异。

　　血管紧张素转换酶 （angiotensin-coverting en-zyme, ACE）基因位于人染色体 17q23 区，在第 16 内含子中含有 287bp 的插入/缺失多态性。 目前认为ACE 基因插入/缺失（I/D）多态性与心脑血管疾病有密切关系，而研究证实 ACE 基因 I/D 多态型与长寿有密切关系。 本研究中长寿组 DD 基因型频率明显高于其余 2 组，D 等位基因频率高于对照组，说明DD 基因型和 D 等位基因是长寿的有利基因。 Faure等研究发现法国百岁老人组 D 型等位基因频率明显高于对照组，D 型等位基因频率在百岁组中更为常见。 Davide 等研究发现，意大利百岁老人中 D/D基因型频率及 D 型等位基因频率明显高于对照组。

　　而一项对欧洲人的研究说明，80 岁以上老年组的ACE DD 基因型和 D 等位基因频率高于对照组，说明 ACE DD 基因型和 D 等位基因有助于健康和长寿。 而在我国对广西巴马壮族长寿人群的调查中同样发现，ACE 基因的 D/D 基因型和 D 型等位基因与巴马老人自然长寿有关，可能有利于长寿或其与长寿关联的可能性大，而 I/I 型很可能不利于长寿或阻碍长寿。

　　载脂蛋白 E（apolipoprotein E, ApoE）位于 19 号染色体上，具有 6 种表现型和 3 种等位基因。 研究显示，ApoE 基因多态性与长寿、心血管疾病、老年痴呆等均有相关性。 尽管在不同的人群中其基因型与长寿关系不同， 但在多个群体的证实 ApoE 是公认的长寿相关基因。 本组研究中，长寿组 ε3/3 基因型频率较老年组升高（P < 0.05），可能是有利于长寿基因；长寿组 ε4/3 基因型频率较对照组明显降低（P < 0.001），较老年组也显著降低（P < 0.01），可能对长寿不利。 Schachter 等报道法国百岁老人的ApoE 基因型频率中，ε2 为 12.8％明显高于年轻对照组的 6.8％， 而 ε4 为 5.8％， 较对照组的 11.2％明显低，ε2 和 ε4 在 2 组之间相差几乎为 2 倍。 由此认为法国老人长寿与 ApoE 基因多态性相关，ε2 具有延长效应，ε4 则有缩短效应。 但是在本组研究中，ε2，ε4 等位基因未表现出有差异。 另有相关研究表明，ε4 等位基因具有明显的升高血清总胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白 B 的作用，而血脂代谢异常在冠心病发病中起重要作用。

　　本研究中，3 组间生化及体重指数、血压等的比较中，体质指数、收缩压、舒张压表现出有差异，但均在正常范围之内，故在本研究中未进一步研究。 3 组间低密度脂蛋白比较也有差异， 长寿组血中低密度脂蛋白含量较老年组和对照组低， 血中低密度脂蛋白含量高可引起血管中脂质沉积增加、 动脉粥样硬化，是心脑血管疾病发生的基础，因此长寿组中的低密度脂蛋白含量低也有利于长寿。

　　本次研究对象生活环境相同，同民族，具有类似的遗传因素，本研究显示，遗传因素决定不同个体的健康长寿， 基因决定人类能否辛免于影响长寿的疾病。多种基因共同作用决定人类能否健康长寿。长寿是年龄依赖的多种因素影响的结果， 长寿的遗传物质与年龄增长相互独立，是属于保守性，可世代传递的祖先基因。由于长寿的机制尚不完全清楚，有研究表明长寿的原因是减少疾病的发生尤其是患心脏病和 AD 的危险性减少和保持良好的机体免疫状态是增长寿命的有效途径。