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中国人乙醛脱氢酶2基因多态性的基因芯片检测方法

来源:未知 作者:傻傻地鱼
发布于:2014-11-07 共4538字
论文摘要

  硝酸甘油作为治疗心绞痛的基本药物之一广泛用于临床。研究发现硝酸甘油的舒血管作用通过释放一氧化氮( NO) 所介导。乙醛脱氢酶 2( ALDH2)具有硝酸酯酶活性,对硝酸甘油转化产生 NO 起了关键作用,而 ALDH2 基因 Glu504Lys 多态性,会导致ALDH2 硝酸酯酶活性显著下降,使硝酸甘油无效概率明显上升( 14.9% vs 42.4% )。文献建议,AL-DH2 504Lys 等位基因携带患者慎用硝酸甘油。

  ALDH2( 504Lys) 等位基因在欧美人群中携带率极低,但在中国人群中携带率较高,部分人群携带率高达 30%。因此,在中国人群中检测 ALDH2( Glu504Lys) 基因多态性具有积极的现实意义。本文研究建立了 ALDH2( Glu504Lys) 基因多态性检测方法,以满足临床检测需求。

  1 仪器和试剂

  PCR 仪[Bioer TC-96 / G / H( b) ,杭州博日科技有限公司]; 离心机( 飞鸽 TGL-16GB 上海安亭科学仪器厂) ; 紫外分光光度计( onedrop1000,上海诺晶生物有限公司) ; 点样仪( GSM417,Affymetrix) ; 生物芯片全自动杂交仪( BR-526,上海百傲科技股份有限公司) ;生物芯片识读仪( BE-2.0,上海百傲科技股份有限公司) ; 基因芯片图像分析软件( Arraydoctor 2.0,上海百傲科技股份有限公司) ; 凝胶电泳仪 ( PowerBC-600BC,上海博彩生物科技有限公司) ,凝胶成像系统( Bioshine Gelx 1520,上海鸥翔生物有限公司) 。

  DNA 提取试剂盒( BST01051,上海百傲科技股份有限公司) ; 杂交显色试剂盒( BST03021,上海百傲科技股份有限公司) ; 醛基修饰的载玻片( BSM03011,上海百傲科技股份有限公司) ; 应用 Primer Premier 5.0软 件 设 计 一 对 引 物: 5 ' Biotin - AAGACTTT-GGGGCAATACAG 3',3' CTTCTCAGGCTTAAAAT GGG5'; 质控寡核苷酸: 5'Biotin -ACATCCTCTGGATGATGT-GAGACCATGCGGAGC CCCTCCACG 3 ',2 条检测探针: 野生型5'( T) 16 CAGGCATACA CTGAAGTGAAAA3',突 变 型 5 '( T ) 16 GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT 3',1 条质控探针: 5 ' NH2-( T) 16 GGTCTCACATCATCCAGAGGATGT 3'( 上海生工生物工程服务有限公司) ; Taq 酶,10 ×buffer[天根生化科技( 北京)有限公司]; dNTP( 上海生工生物工程服务有限公司) ; EDTA 抗凝外周静脉血样本( 上海市第一人民医院赠送) ; 胆红素( CAS#35-65-4,上海源叶生物有限公司) ; 胆固醇( CAS#57-88-5,99%,上海将来实业有限公司) ; 三酰甘油( CAS#538-24-9,上海将来实业有限公司) 。

  2、 方法与结果

  2. 1 临床样本

  EDTA 抗凝外周静脉血样本( 上海市第一人民医院、长征医院、华东医院) ,不分病种、检测目的、性别、年龄,只要满足双向测序和芯片检测对样本量要求即可入选。

  2. 2 样本处理

  对 EDTA 抗凝外周静脉血样样本,用 DNA 纯化试剂盒( 上海百傲科技股份有限公司) 提取全基因组DNA。DNA 浓度为 10 ~ 60 ng·μl- 1,A260/A280 的比值在1.5 ~2.0。取已纯化的 DNA 3.0 μl作为扩增模板,加入上游引物( 10 pmol·μl- 1) 、下游引物( 3.3pmol·μl- 1) 各1.0 μl,Taq 酶( 2.5 U·μl- 1) 1.0 μl,10 × buffer 2. 5 μl,dNTP( 各2. 5 mmol·L- 1) 2.5 μl,双蒸水14 μl,反应总体积 25 μl。PCR 反应条件为:50℃ 5 min; 94℃ 5 min; 94℃ 25 s,60℃ 25 s,72℃ 30s,35 cycles; 72℃ 5 min; PCR 产物 4℃ 保存。

  2. 3 ALDH2 基因芯片的制备

  将探针用少量纯水溶解制备高浓度溶液,分别用2 × 点样缓冲液配制各探针的点样液,将各点样液按照要求依次加入到 384 孔板中。使用醛基修饰基片作为 ALDH2 基因多态性检测芯片制造的固相支持物。采用 GSM-417 生物芯片点样仪,根据设计的阵列图1 的点阵排布,进行点样。点样后置于恒温箱中固定,避光保存。点样时,环境温度在 18-26℃,相对湿度为45% ~65%。探针点样浓度为:5 μmol·L- 1。

  将点好的芯片置于室温过夜固定。

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  2. 4 杂交检测

  在 BaiOe-Hyb 全自动杂交仪按表 1 设置反应程序,按表要求用量分装杂交显色试剂盒各试剂。吸取150 μl 杂交液,分别加入包含上述两个检测位点的扩增产物各10 μL,混匀。并将各试剂放入指定位置内,运行程序,杂交显色反应自动进行。杂交完成后,将芯片显色区用蒸馏水轻微冲洗、烘干,将芯片放入BE-2. 0生物芯片识度仪中进行扫描,获得的芯片杂交结果图像,用基因芯片图像分析软件( Arraydoctor2. 0,上海百傲科技股份有限公司) 提取各点的信号强度,输入基因判型的阈值,由软件进行数据分析,输出芯片检测的基因型结果。

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  2. 5 ALDH2 显色基因芯片性能评价

  2. 5. 1 芯片检测灵敏度 选取经测序验证 ALDH2基因型为 Lys504Lys 的样本,提取基因组 DNA,浓度调整为50 ng·μl- 1,进行梯度稀释。将每个稀释度DNA 进行 PCR 扩增并与芯片杂交,以重复三次检测判型结果均正确的最低 DNA 量为检出限。经试验确定检出限为5 ng 基因组 DNA。

  2. 5. 2 芯片检测准确度 选取 3 种 ALDH2 基因型的浓度为50 ng·μl- 1基因组 DNA,分别进行 PCR 扩增并与芯片杂交。结果 3 种基因型样本检测结果均正确。

  2. 5. 3 芯片检测特异性 取鱼精 DNA 稀释至接近于正常人基因组 DNA 抽提浓度( 20 ng·μl- 1) 作为阴性对照进行 PCR 扩增并与芯片杂交。检测结果为阴性。

  2. 5. 4 芯片检测重复性 选取 ALDH2 基因型为Lys504Lys 的浓度为 25 ng·μl- 1基因组 DNA,进行PCR 扩增并与芯片杂交,每个样本重复检测 10 次。10 次检测结果基因型均一致。

  2. 6 ALDH2 显色基因芯片干扰实验

  取2-8℃保存不超过5d 的三种 ALDH2 基因型别( ALDH2 Glu504Glu 编号: H1; ALDH2 Glu504Lys 编号: H2; ALDH2 Lys504Lys 编号: H3) 的 EDTA 抗凝外周全血样本,每种样本分成 5 份,1 份不加干扰物作为空白对照( 编号: 空) ,1 份加入3 000 mg·dl- 1三酰甘油( 编号: G) ,1 份加入250 mg·dl- 1胆固醇( 编号:Ch) ,1 份加入 20 mg·dl- 1胆红素( 编号: Bi) ,1 份完全溶血( 编号: He) 。按照血液基因组 DNA 提取方法提取上述样本血液基因组 DNA,经 PCR 扩增并与芯片杂交检测基因型,每种样本重复 2 次,H3 基因型的样本量较少,只操作1 次。

  研究结果显示,含有上述干扰物质的血样,经DNA 提取后,DNA 的浓度和纯度与正常空白血样相比,没有显著差异,经 PCR 扩增及基因芯片杂交检测,结果正常并与已知基因型一致。因此 EDTA 抗凝全血样本中含有 3 000 mg·dl- 1的三酰甘油,250 mg·dl- 1的总胆固醇,20 mg·dl- 1的胆红素,对 ALDH2基因芯片测定没有影响,完全溶血的 EDTA 抗凝全血对测定也没有影响。

  2. 7 ALDH2 显色基因芯片精密度实验

  选择3 种 ALDH2 基因型已知( 双向测序) 的样本,每个样本分成三份,分别送三个参加临床实验的实验室用申报试剂盒测定。每个实验室采用三个批号的试剂盒,每个批号试剂对每个样品由同一实验室的三名检验员各测定三次。根据正确测定结果占总测定结果的百分率计算试剂盒产品的批内,批间精密度和差异。

  精密度实验共获得243 个检测结果。243 个检测结果与已知基因型均符合。以定性结果评价,批内批间均无差异。

  2. 8 ALDH2 显色基因芯片方法比对实验

  将基因芯片检测结果与双向测序法检测结果比较,评价 ALDH2 显色基因芯片方法临床适用性。选择三家医疗机构实验室,共获得 1035 份来自临床检验的 EDTA 抗凝血样。将选取的临床病人检测样本一分为二,一份直接送交选定的基因测序机构对样本基因组 DNA 中 ALDH2 基因的 Glu504Lys 位点进行双向测序; 一份进行芯片检测。芯片检测或测序不成功的样本予以剔除。

  方法比对研究数据见表2,共获得1026 个基因芯片检测结果和1012 份双向测序结果。样本存在 3 种ALDH2 基因型如图 2 所示。经统计有 1009 份样本基因芯片检测结果和基因测序结果均完整,比对分析,有1007 份基因型检测结果与测序结果完全一致,有2份样本结果不一致,芯片检测结果为 ALDH2( G/G)型,测序结果为( G/L) 型。经实验分析,可能的原因是样本 DNA 提取失败,浓度低于检出限所致。统计结果显示,测试试剂盒临床检测的检出率为: 99.13%( 1026/1035) ; 正确率为:99.80%( 1007/1009) 。

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  2. 9 ALDH2 显色基因芯片稳定性实验

  取制备好的 ALDH2 基因芯片 24 片及配套的PCR 扩增及杂交显色试剂,置于 - 20℃ 冰箱长期储存,分别于0,1,3,6,12,18 个月取出3 片,用新鲜 ED-TA 抗凝血样提取的浓度稀释至 8 ng·μl- 1的杂合DNA 进行 PCR 扩增并与芯片杂交,结果与新制备的ALDH2 基因芯片及配套的 PCR 扩增及杂交显色试剂检测结果比较。实验结果见表3,ALDH2 显色基因芯片及其配套试剂,在 -20℃储存18 个月,检测灵敏度没有明显变化,具有良好稳定性。

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  3、 讨论

  3. 1 芯片设计

  临检用基因芯片的设计包括探针结构的设计; 质控探针的考虑; 探针浓度的选择; 阵列排布的设计等。在探针结构设计上,为便于探针固定在醛基基片上,探针的5'端进行氨基修饰; 为保证探针与扩增产物杂交反应的充分性,减小反应的空间位阻,在探针与氨基之间还可以包含一段 5 ~25 聚的聚脱氧胸苷酸。

  质控探针的设置应当以达到质量控制目的为原则。

  本研究基因芯片设置的质控探针可以同时起到阳性质控探针和化学修饰探针的作用。该探针与检测探针一样只进行了5'氨基修饰,在基片上的固定效果可以反映探针修饰质量; 同时该探针只与反应体系中外加的带有生物素标记的靶标( 质控寡核苷酸) 发生特异性杂交反应,该反应只与杂交过程相关,故可用于监控杂交过程的质量。鉴于芯片是用于人染色体基因检测,可以不设置阴性对照探针和内对照探针。使用本芯片时,需用阳性对照品和阴性对照品建立严格反应条件,并定期重复上述实验来控制芯片杂交的特异性。对于芯片阵列的设计,必须考虑有助于克服点样误差、实验偏差、软件自动分析结果时可能出现误判的各种可能。通常将阳性对照探针按一定规则排布,便于软件自动对阵列的定位、寻点、采集信号。每个探针点的重复次数最好不少于 3 次,取平均值可克服点样误差。本研究每个探针重复 6 次,交叉排列,除有利于克服点样误差,还可发现由于实验偏差导致的信号不均匀分布导致的误判。

  3. 2 芯片性能评价

  基因芯片检测技术操作简便、可快速、准确、高通量的分析数以千计的基因组信息,非常适合于常规临床检验。评价基因芯片性能的方法和指标必须与实际应用相对应。临床检验关心的性能指标主要包括: 准确性、灵敏性、特异性、重复性、抗干扰性、稳定性等。评价上述指标时,应当使用真实的临床样本,而不建议使用质粒。质粒比基因组小很多,比较纯,试验结果与真实样本差异很大。在评价灵敏性时,宜选择杂合型样本。同等浓度下与纯合子相比,杂合型样本等位基因的拷贝数减半,对扩增的影响更大。评价重复性时,选择中等浓度 DNA 更有代表性。

  3. 3 测定结果分析

  文献报道,ALDH2 504Lys 等位基因在欧美人群中携带率极低,但在中国汉族人群中的携带率 17%~ 36% 不等。本研究检测结果显示上述等位基因携带率为22. 4%,与文献报道一致。硝酸甘油作为心绞痛治疗药物,使用无效常常会产生严重后果。

  而携带 ALDH2 504Lys 等位基因导致硝酸甘油无效概率大幅上升,因此在临床开展基于 ALDH2 的硝酸甘油用药指导符合医疗机构药事管理规定对临床药师为临床开展个体化用药指导的要求。但大部分临床药学实验室对遗传分析检测方法缺乏经验,对自动化操作、结果准确、方法稳定可靠的基因检测技术需求强烈。本研究建立的显色基因芯片检测方法,自动化程度高,操作简便,结果准确,满足临床基因检测需求,可以推广。

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