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哺乳动物个体性别的决定基因研究

来源:学术堂 作者:韩老师
发布于:2015-05-04 共6332字

  哺乳动物个体性别虽在受精时就已决定,但直到胚胎发育到一定阶段,具有两性分化潜能的原始性腺才分化为睾丸或卵巢,而次级性别差异(第二性征)则在性腺分化并获得内分泌功能(性成熟)后才出现。这一性别决定过程的正常进行有赖于多种性别决定基因的相互作用,如与原始性腺发育有关的SF1、Wilms肿瘤易感基因(WT1),与睾丸发育有关的SRY、SOX9基因,与卵巢发育有关的WNT4、RSPO1基因,等等。它们处在基因调控网络的上下游,通过相互协同或拮抗而发挥作用。随着越来越多重要的调节基因被发现,对决定哺乳动物性别的基因调控网络的认识也在不断丰富。

  一、与原始性腺(双向分化潜能)发育有关基因
  
  1.SF1:SF1编码类固醇生成因子-1(SF1),其表达先于Y染色体性别决定基因(SRY),与性腺中支持细胞和间质细胞的形成有关,并介导SRY表达上调[1].

  Sf1基因缺失的小鼠性腺及肾上腺均发育不全,性腺的发育在早期未分化阶段即停止。故XY小鼠体内Müller管不退化而分化为子宫、输卵管及阴道上段,使其发生完全性反转[2].在性腺发育后期,SF1可在睾丸支持细胞和睾丸间质细胞中表达,产物SF1协同SOX9调节抗Müller管激素(AMH)基因及其它性腺发育相关基因的表达水平。有研究表明SF1可协同SRY结合于SOX9的特定序 列,上 调SOX9表 达,产 物SOX9则 取 代SRY,与SF1进一步上调自身基因的表达水平,即SOX9的正 反 馈 调 节[3].在 人 类,SF1突 变 导 致46,XY个体性腺发育不全,还与46,XX个体的原发性卵巢功能不全有关[4].

  2.WT1:WT1编码一类锌指结构的转录因子。

  在某些性腺相关的综合征患者体内可检测到WT1突变,如WAGR综合征(Wilms瘤、无虹膜、泌尿生殖器畸形及智力低下)、Denys-Drash综合征(性腺畸形和肾衰竭)、Frasier综合征(46,XY个体性腺发育不全)[5].

  Wt1突变的小鼠肾脏和性腺不发育,通常在胚胎阶段即死于心脏缺陷。

  在WT1转录的RNA剪切过程中,由于剪切位点不同而导致第3、4锌指结构间3个氨基酸残基(KTS,即赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸)的嵌入或缺失,形成+KTS和-KTS两种WT1蛋白亚型,它们在胚胎形成过程中发挥的作用不同。

  -KTS亚型可结合于SRY启动子而反式激活SRY,也可 结 合 于SF1的启动子激活SF1表达[6],表明SF1可能是WT1的靶基因。

  +KTS亚型的作用可能是调节SRY转录水平,另有证据表明该亚型可协同SF1增强Amh基因表达,从而限制Müller管发育[7].

  3.LIM同源框基因-9(Lhx9):Lhx9缺失的小鼠,其胚胎时期原始生殖细胞可正常迁移,但生殖腺嵴中体细胞无法增殖,性腺形成受阻,由于缺乏睾酮和AMH,XY小鼠表型为雌性。研究表明,缺少LHX9的 生 殖 腺 嵴 中Sf1表 达 水 平 极 低,提 示Lhx9可能是Sf1的上游基因[8].体外实验还显示LHX9可 协 同WT1结 合 并 反 式 激 活Sf1启 动子[6].

  Gata4敲除的胚胎中,LHX9水平显着降低,提示Gata4为Lhx9的表达所必需,为Lhx9的上游基因[9].Lhx9在人类早期性腺发育中的作用尚不明确。

  4.M33:M33在妊娠第7周即在人类胚胎的生殖腺嵴中表达。在大多数XY小鼠体内,M33基因缺失导致性反转;在XX小鼠则体现为卵巢的体积减小或缺失。研究发现,M33敲除的XY小鼠,其生殖细胞在胚胎期提早进入减数分裂阶段;而雌性突变体减小的卵巢内生殖细胞数目明显减少且染色体联会异常的卵母细胞比例增高,提示M33蛋白对雄性生殖细胞减数分裂阻滞、雌性生殖细胞同源染色体正常联会及染色体稳定性都有重要作用[10].

  人类病例中,在1名核型为46,XY,但内外生殖器官的表型均为女性的患者体内检测到M33编码区突变。由于M33缺失在两性都可引起明显的性腺缺陷,说明M33作用时间在性别决定前的早期性腺发育阶段[11],与其表达时间相一致。最近的研究发现,M33缺失的XY小鼠性腺内几乎检测不到Sry表达,但若通过转基因方法使其表达Sry、Sox9则可纠正性反转,提示M33可能作用于Sry上游调节其表达[12].

  5.Insr、Igfr1:Insr和Igfr1分别编码胰岛素受体(INSR)和类胰岛素生长因子受体-1(IGFR1),二者对小鼠肾上腺及生殖器的发育和初级性别决定都是不可或缺的。

  INS/IGF信号通路的缺损在原始性腺中导致性别分化之前体细胞的增殖速率下降,同时伴随数百种性腺发育相关基因的表达下调。

  总的来说,缺乏功能性INS/IGF信号的胚胎表现出:(1)肾上腺皮质完全不发育;(2)XY性腺性别反转;(3)卵巢分化延迟,即XX和XY性腺未分化状态延长。

  Insr/Igfr1双敲除的XY性腺中,Sry表达水平下降和表达时间延迟导致其下游基因Sox9表达水平也明显降低,SOX9无法达到使睾丸支持细胞形成所需阈值,进一步导致睾丸间质细胞分化失败、类固醇无法生成。有研究发现,Sry表达启动后,初级性索细胞内立刻开始糖原累积,这一能量储备过程与Sox9上调、睾丸索形成以至睾丸整体发育关系密切,而该过程依赖于INS和IGF,故在Insr/Igfr1双敲除的XY性腺中,多种糖原合成所需酶类水平均下降,这是睾丸发育缺失的另一原因。

  Insr和Igfr1基因双敲除的XX性腺中,某些卵巢决定因子缺失(如FOXL2)及相关基因表达下降(如Wnt4),与视黄酸合成相关的酶水平也下降(细胞进入减数分裂期需视黄酸诱导),共同导致卵巢分化延迟至胚胎第16.5天(E 16.5)[13].

  二、睾丸发育相关基因
  
  1.SRY:SRY是Y染色体上决定雄性性别的基因片段,在性别决定中起开关作用。人类SRY位于Yp11.3.SRY编码的蛋白质含有DNA结合域(高泳动 类 非 组 蛋 白 盒,HMG-box),该 结 构 域 介 导SRY进入胞核,其非极性蛋白质侧链嵌入DNA特定区域α-螺旋的小沟与其结合并使之弯曲60°~85°,反式激活所结合的DNA.几乎所有导致XY个体性反转的SRY突变都存在于HMG-box内,且HMG-box在哺乳动物种系间具有高度保守性,表明SRY蛋白除HMG-box以外的部分在性别决定中只发挥次要作用,如维持SRY蛋白构象稳定性、促进SRY与DNA的结合等[14].

  SRY基因对睾丸发育的启动有赖于其下游一系列基因的表达。目前确定SRY通过与Sox9的TESCO序列结合反式激活Sox9,故SOX9是SRY的靶基因[15-16].此外,WT1也可能是SRY的靶基因。人类胚胎内SRY在E41开始表达,SRY的表达时间和表达水平关系到其功能的行使,表达过迟将导致睾丸发育不良,表达水平只有达到阈值才能正常诱导睾丸的发育。

  2.GATA4和FOG2:Gata4编 码 的 蛋 白GATA4含有两个锌指结构,在识别结合DNA、稳定蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质之间相互作用方面发挥 重 要 作 用。

  GATA4与 一 些 蛋 白 质 如SF1,FOG2,WT1等协同作用,调节SRY、SOX9、AMH等性别决定基因的表达[17-18].

  实验显示,小鼠体内GATA4氨基端锌指结构突变阻碍了GATA4与FOG2相互作用,导致睾丸发育严重畸形[19].在人类,最近的一例家族病例显示,GATA4杂合型功能缺失性突变导致该家族3名46,XY个体发生性发育疾病,表现为外阴性别不明或阴茎长度缩短。研究发现这一突变蛋白无法结合并激活AMH的启动子,也无法与FOG2结合发挥协同作用[20].

  新的研究发现,Gata4不仅影响睾丸发育,对于生殖腺嵴形成更是不可或缺,它在原始性腺增厚前即在体腔上皮细胞内表达。

  Gata4缺陷的小鼠胚胎无法形成原始性腺,体腔上皮仍停留在未分化的单层上皮阶段[9].

  3.SOX9,SOX8,SOX10:SOX基因家族编码的转录因子均有一保守基序HMG-box,可与DNA序列特异性结合。哺乳动物SRY基因即为该家族成 员,此 外 家 族 中 另3名 成 员,SOX9、SOX8、SOX10,也在XY个体的性腺中表达。

  在小鼠胚胎,Sox9起初在两性生殖腺嵴中低水平表达,但Sry表达后,Sox9在睾丸支持细胞中的表达水平即迅速上升。已证明SRY可启动SOX9表达,但有实验表明Sox9可在Sry缺席的情况下启动转录,说明另有激活Sox9表达的途径。观察结果显示含有Dax1无效等位基因或FGF9突变蛋白的小鼠因体内Sox9表达水平下降而导致性反转,但Sry的表达水平却与野生型小鼠相仿[21-22],说明DAX1和FGF9可能也有上调Sox9表达的作用。

  关于SOX9作 用 的 下 游 靶 基 因,研 究 显 示SOX9与SF1共同调节Amh基因的表达,前者启动Amh转录,后者主要调节其转录水平。体外实验还发现Sf1在睾丸支持细胞中表达的维持及Vanin-1(Vanin-1编码泛酰巯基乙胺酶,其产物可保护原始生殖细胞免受氧化应激的伤害)的表达也有赖于SOX9,故这两种基因也可能是SOX9的靶基因。

  动物实验中,条件敲除Sox9基因的小鼠XY胚胎出现卵巢发育,而过度表达Sox9的XX胚胎出现睾丸发育,说明SOX9的存在及表达水平在性别决定中的重要性[3].人类病例显示,包含SOX9的序列或SOX9上游序列重复导致XX个体出现睾丸,SOX9上游基因易位导致XY和XX个体的性反转,SOX9上游序列缺失导致XY个体出现卵巢发育、男性性腺发育不全、外阴性别模糊等症状。病例分析显示,人类SOX9基因的睾丸特有调控元件较小鼠复杂得多[23].虽然SOX9在睾丸发育过程中作用关键,但其对睾丸支持细胞的维持和睾丸索的完整 性 似 乎 作 用 甚 微,猜 想 同 族 因 子SOX8及SOX10或可功能性替代SOX9.

  小鼠体内Sox8基因于E13.5d时在睾丸索内的睾丸支持细胞中表达。研究显示,Sox8-/-雄性小鼠生育力降低,提示Sox8对雄性生育力的维持有重要作用。还有实验表明SOX8可与SF1协同作用,结合于Amh的启动子激活其转录,这支持了在睾丸发育中SOX8和SOX9功能重复这一假设,发生原因可能是两者来源相同[24].

  Sox10基因无效表达的XY小鼠并未观察到睾丸异常,但其在XX小鼠性腺内的过度表达却可诱导睾丸发育,显示Sox10虽不是睾丸发育的必需基因,但仍可作为睾丸决定基因发挥作用[25].此猜想在人类病例中得到支持,46,XX睾丸化患者体内检测到包含SOX10在内的基因序列重复[26].病因不排除与该重复序列内其它基因有关,但SOX10仍是最有可能的候选致病基因。

  4.DMRT1:DMRT1持续在睾丸支持细胞中表达。在人类和小鼠,DMRT1对XY个体出生后睾丸支持细胞和生殖细胞的维持不可或缺。

  Dmrt1无效表达的小鼠在胚胎期性腺可正常发育,但在出生后2日即因生殖细胞雌性化而严重损害睾丸发育。小鼠睾丸支持细胞中DMRT1缺失使Foxl2表达上调,引起睾丸支持细胞重编程而转变为颗粒细胞,卵泡膜细胞也随之形成,这些细胞分泌的雌激素最终导致生殖细胞雌性化[27].相似地,在人类病例中,含有半合子DMRT1基因的46,XY个体表现出睾丸发育不良。但因涉及该基因的病例较少,其对人类睾丸发育的调控机制尚未阐明[28].

  5.FGF9:FGF9编码纤维母细胞生长因子-9(FGF9),在细胞增殖、存活、迁移、分化等不同阶段均发挥作用。

  Fgf9无效表达的XY小鼠发生性反转且睾丸支持细胞发育受损。曾经认为发生机制是FGF9缺失时Sox9的表达无法维持,睾丸支持细胞分化异常,导致睾丸无法正常发育,体细胞表达卵巢发育相关基因[22].但最近的研究发现,Fgf9、Sox9、Wnt4之间存在更复杂的相互作用:Fgf9及其受体Fg-fr2缺失的XY小鼠性腺内Wnt4的表达激活,且Fgf9、Wnt4均缺失的XY小鼠睾丸仍可发育,表明FGF9虽可抑制卵巢发育相关信号通路,但对Sox9表达的维持并无直接作用[29].

  FGF9作为胚胎睾丸中抑制减数分裂发生的重要蛋白,与减数分裂诱导剂视黄酸(RA)之间存在明显的拮抗作用。

  FGF9直接作用于生殖细胞,通过维持全能性标记物OCT4和SOX2的表达,降低雄性生殖细胞对RA的敏感性[30].

  6.Six1&Six4:Six1、Six4基因编码同源异型蛋白Six1、Six4,两种蛋白均缺失的XY小鼠性腺发生性反转并无法激活Sry转录,突变性腺中还观察到前体细胞数目减少及性腺体积减小。

  目前认为Six1/Six4有Sf1、Fog2两个下游靶基因,故对小鼠性腺的影响是由两个不同的转录调控网络调节的。一方面,Six1/Six4反式激活Sf1,Sf1在Sry表达启动前参与调控性腺中前体细胞的生长,故可决定性腺体积;另一方面,Six1/Six4反式激活Fog2,FOG2可与GATA4共同上调Sry表达,故与雄性性腺分化有关[31-32].

  7.MAP3 K1、MAP3 K4:近年促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在人类和小鼠性别决定中的作用逐渐引起重视。一些病例中MAP3 K1的突变改变其下游靶分子的磷酸化水平,最终使46,XY患者表 现 为 部 分 或 全 部 性 腺 发 育 不 全。同 族 基 因MAP3 K4也被发现与性别决定相关。研究发现,在Map3k4的编码区可发生byg突变(一种无 义突变),使酪氨酸受体激酶结构域发生区域截断。在byg突变纯合子小鼠体内,Sry表达明显下降,睾丸特有的细胞活动,如体腔上皮细胞增殖、中肾细胞迁移等均受到损害,相反,卵巢促进基因的表达却被上调,最终导致XY小鼠的性反转[33].

  8.Gadd45g:生长抑制和DNA损伤诱导45G蛋白 (Gadd45G)是 所 属 蛋 白 家 族 中 唯 一 能 调 节SRY水平的蛋白质。

  Gadd45g在雌雄两性的早期性腺中表达水平相似,但在11.5dpc这一性别分化的关键时间在XY性腺中表达水平达到顶峰。在不同基因背景中,Gadd45g缺陷的XY小鼠表现出从不育至雌雄间性表型等不同程度的DSD或发生完全性反转[34].该现象的分子机制是Sry表达的级联反应---MAP3K4和GADD45G在MAPK通路中起到转换信号的作用,使GATA4磷酸化而激活,活化的GATA4与Sry的启动子结合并激活其转录,从而启动男性性别决定过程。当Gadd45g基因缺陷时,这一通路被抑制,最终使Sry表达被破坏,导致卵巢和Müller管发育[35].

  虽然至今未有人类Gadd45g-/-个体的报道,但Gadd45g-/-小鼠 表 现 出 的 完 全 性 反 转 以 及Gadd45g是Sry上 游 激 活 因 子 的 事 实 都 提 示Gadd45g可能是人类无综合症候的男性不育和46,XY个体部分或全部性反转的致病基因。

  三、卵巢发育相关基因
  
  1.WNT4:Wnt4于E9.5在两性胚胎中表达,E11.5时,Wnt4在男性性腺中表达下调,在女性性腺及Müller管周围间质中的表达仍维持。可知在原始性腺阶段,Wnt4与雌雄胚胎Müller管形成有关[36].Wnt4-/-XX小鼠表现出部分性反转,这些突变小鼠的性腺形态类似睾丸,但不形成睾丸索或表达睾丸支持细胞特有标记;Müller管消失而Wolff管继续发育。携带WNT4突变的患者症状与突变小鼠表型类似[37].说明该基因可抑制男性特有的脉管系统在卵巢内形成,可能是通过抑制Sox9表达上调实现的。但功能获得性实验发现,异位表达Wnt4的雄性小鼠仍可形成雄性体腔脉管(形态和分支存在畸形),表明WNT4并非卵巢内唯一抑制男性脉管系统形成的因子或睾丸可表达某种对抗WNT4抑制作用的因子[38].

  2.RSPO1:Rspo1敲除的XX小鼠形成雄性化性腺,但不表现为完全的性反转,这与Wnt4无效表达的XX小鼠的表型相似,提示二者作用于同一信号通路(激活β-连环蛋白)[39].进一步研究发现,在Rspo1-/-的XX小鼠性腺内,Wnt4的表达水平降低,经典Wnt信号通路无法激活,表明RSPO1是Wnt4上游的正调节因子,其编码的分泌因子可维持β-连环蛋白的稳定[40].

  目前已在多例46,XX睾丸性患者体内检测到RSPO1突变,表明RSPO1也是人类卵巢发育中的关键基因。

  RSPO1和WNT4都可促进卵巢发育而抑制睾丸发育,在46,XY性腺发育不良患者体内检测到染色体1p上含有RSPO1和WNT4的片段重复可支持这一事实。

  3.FOXL2:对Foxl2基因敲除、Wnt4基因敲除、Foxl2和Wnt4基因双敲除三种小鼠的研究显示,Foxl2和Wnt4基因双敲除的XX小鼠表现出睾丸分化和男性生殖细胞发育,说明Foxl2基因对颗粒细胞的形成必不可少[41].此外,对成年XX小鼠进行Foxl2基因条件敲除,发现其卵巢转分化为睾丸,卵巢结构、导管形态及体细胞均表现出男性化特征,分子水平上Sox9等睾丸分化相关基因的表达上调[42].该结果表明即使在成年时期,Foxl2仍对卵巢形态和功能的维持起到重要作用。在人类,FOXL2突变通常与BPES综合征有关,患者常伴有卵巢机能障碍(如卵巢早衰等)[43].最近的研究发现,Foxl2敲除的小鼠体内Sf1表达水平远高于正常小鼠,且该表达水平的改变与上游调控分子WT1、LHX9无关;进一步的实验证明,FOXL2通 过 直 接 与Sf1启 动 子 的 特 定 位 点1结合而抑制Sf1的表达[44].哺乳动物的性别决定是众多基因参与的复杂程序,某一基因的功能丧失或表达失控,都将对其他基因产生重大影响,导致两性发育异常。虽然目前对性别调控机制有了一定程度的认识,但这种认识并不系统完整。随着生命科学的不断发展,哺乳动物的性别决定机制这个谜团将逐步被解开,这将为多种人类性发育疾病的治疗带来光明。

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