麦冬多糖的提取分离及护肤霜配制

　　中 药 麦 冬 是 百 合 科 （Lihaceea）沿 阶 草 属（Ophiopogon）植物麦冬（Ophiopogonis japonicus）的干燥块根，始载于《神农本草经》，被列为上品，历代本草都有记载，亦是历版《中国药典》[1]收载的常见药食同源类药材。中医理论认为该药味甘、微苦，微寒，具有养阴生津、润肺清心之功效，临床上常用于肺燥干咳、虚劳咳嗽、津伤口渴、心烦失眠、内热消渴、肠燥便秘等症[2].

　　麦冬含多种化学成分，科研工作者先后从麦冬中分离出多糖、皂苷、黄酮等化合物。这些成分共同作用使麦冬具有广泛的药理作用，主要表现为抗心肌缺血和心肌梗塞作用、免疫调节作用、降低血糖作用、抗肿瘤作用等。其中，麦冬多糖因含量较高，提取工艺相对简单，已成为诸多学者研究的对象。口服麦冬多糖具有减肥功效[3],是新时代保健品领域潜力巨大的绿色添加物。这也是本研究将麦冬多糖作为提取对象的一个原因。在化妆品应用方面，麦冬多糖有良好的持水性，是一种天然的保湿成分，对皮肤的黏附性强，伸展性高，可用于唇膏、口红和粉饼膏霜中，经细胞学功效检测，它还具有抗氧化、延缓衰老等生物活性。但是，从已报道的文献资料不难看出，麦冬多糖的提取方式多样，分离纯化手段混杂，没有一个良好的标准化生产工艺。鉴于此，为了满足麦冬在保健品和化妆品行业的应用，特别是中医药“体质养颜”方面的需要，本研究通过正交试验确立了一种适合于工业化生产及应用的工艺条件，推动传统中草药在化妆品和保健品等领域的推广应用。

　　1 多糖的提取分离方法

　　多糖主要采用溶剂提取的方式，多数采用水提醇沉的分离方法，辅以现代技术如微波、超声波以及超临界流体等。麦冬多糖属于植物多糖，又是一类杂多糖，其组成中果糖和葡萄糖的摩尔比约为15∶1[4],极易溶于水，大多难溶于高浓度乙醇，据此，采用水提醇沉的方式可有效提取分离出麦冬多糖。

　　水提物除杂浓缩后，可过大孔吸附树脂[5]或者是用DEAE纤维素柱分离制备精制麦冬多糖，也可通过梯级醇沉进行分离纯化。

　　1.1麦冬多糖的提取

　　通过前期的预试验摸索，以提取物的固含量为考察指标，我们最终确定了如下提取工艺：取干燥的麦冬块根300g,先以500mL的95%（体积分数，下同）乙醇进行索氏提取4h,除去脂溶性杂质以及皂苷和黄酮等（醇提物可用于后期的黄酮和皂苷提取），挥去乙醇后，烘干，然后水提。水提条件为：按料液体积比1∶6提取3次，每次90min,保持微沸。

　　水提液抽滤除杂后，浓缩至450~500mL,此时黏度刚好为5mPa·s左右，符合醇沉需要，加入95%乙醇使醇体积分数为65%,静置过夜，除去下层絮状沉淀后，往上清液内继续添加95%乙醇至醇体积分数达80%,静置过夜，收集下层亮黄色黏稠沉淀，上清液继续加乙醇至醇体积分数为85%,静置过夜，合并收集沉淀，沉淀于50℃烘箱内烘干并不断搅动至恒重，粉碎，过80目（孔径约0.2mm）筛，得乳白色粗多糖粉末71.84g,计算得率为23.61%,纯度为93.8%.此粉末常温密闭放置六个月，未出现任何吸潮、结块、变色情况，可长期保存，便于企业贮存和使用。

　　1.2正交试验确定提取工艺

　　以料液体积比、提取温度、提取次数、提取时间为研究因素，以提取物固含量为考察指标，设计一正交试验L9（34），确定最佳提取工艺。取醇提后烘干的麦冬块根9份，每份20g,依次试验，所得液体过滤除杂后浓缩至50mL,然后检测固含量，因素水平设计见表1,正交试验结果见表2.根据正交试验结果并结合提取经验，我们最后确定最佳提取工艺为料液体积比1∶6,提取3次，每次90min,提取温度为100℃.此工艺下得到的提取率高于最优组合D3A2B1C3.
　　
　　1.3浓缩比例的确定

　　水提液进行醇沉前必须浓缩至一定比例，如果浓缩得不够也即是溶液过稀，直接加95%乙醇后，既浪费原料，而且达不到预期的醇沉效果；如果浓缩得太过了，即溶液太黏稠，再加95%乙醇会导致过多的杂质粘附在糖类上一起沉淀出来，不能进行有效的除杂、分离操作。所以，进行适当比例的浓缩是醇沉的关键！

　　本文借鉴日化产品生产工艺中采用的“黏度”工艺标准，对麦冬多糖水提液的浓缩进行量化，对比其他文献采用的“相对密度”标准[6],此方法同样简单可行，而且能进一步开拓思路。

　　按上述提取工艺，取醇提后的水提液，浓缩成稠膏（含水量极低），然后各取10g分别盛放于5个100mL的烧杯内，编号①、②、③、④、⑤,依次加水稀释，稀释比例1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4（均为体积比，下同），然后加入95%乙醇，使5份溶液中醇体积分数均达到65%,静置过夜，观察醇沉效果。

　　①和②下层都是黏稠状沉淀，晃动后无絮状物漂浮；③④⑤可见明显絮状沉淀，分散度依次升高，絮状物的量依次减少。由此，我们确定了③和④为65%醇沉时的范围。再取稠膏，按照1∶1和1∶1.4的比例进行稀释，然后测其黏度和相对密度，确立了醇沉时的黏度范围为4.6~5.1mPa·s,计算出相对密度约为1.15.此相对密度与文献[7]所记载的“浓缩至相对密度为1.25”相近，但是醇沉分离效果却有很大的提高。因为后者的醇沉沉淀中含有大量有用的多糖，也就是前面所提到的浓缩过度所致的不良后果。

　　按此条件进行65%醇沉的重复性试验，再现性良好。通过多次试验证实，可取300g醇提后的麦冬块根进行工艺水提，浓缩至水溶液为450mL,此时检测黏度恰好为5mPa·s,即可进行65%醇沉除杂。

　　1.4大孔树脂分离纯化

　　AB-8大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24h,装柱，确保无气泡，水洗至水洗液与水1∶2混合不变白为止。将85%醇沉多糖加水溶解，上柱，分别以纯水、30%乙醇、50%乙醇和95%乙醇洗脱，收集水洗脱液，浓缩后进行85%醇沉，收集下层多糖，烘干，粉碎。对比未过柱所得多糖，二者外观无明显区别。同时进行蛋白质含量测定，看是否有过柱的必要。试验表明，过柱除蛋白虽然可行，但是不适于工业化应用。

　　2 相关检测

　　2.1纯度测定

　　利用高效液相色谱法测定多糖的纯度，所用仪器及检测条件如下：P1202高压恒流泵，大连依利特分析仪器有限公司；RI-101示差折光检测器，日本Shodex公司；pH计，瑞士Mettler-Toledo公司；AE100分 析 天 平，瑞 士Mettler-Toledo公 司；TSK-GEL G2000SW（7.5mm×300mm），日本东曹株式会社；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，天津科密欧化学试剂开发中心。

　　色谱条件：流动相为pH 6.0的磷酸缓冲液；流速0.5mL/min;检测器温度30℃;柱温为室温；柱压0.9MPa.三个样 品，分 别为80%醇 沉 所 得 多 糖 粉 末，85%醇沉所得多糖粉末以及过柱所得多糖粉末，分别编号为②、③、④.然后称量②号样品0.021 1g、③号样品0.020 7g、④号样品0.020 8g,分别于10mL容量瓶中加纯水定容。多糖纯度（峰面积百分比）见表3,高效液相色谱图见图1.从图1中明显可以看出，提取分离的多糖主要有3种，其中出峰最早的多糖相对含量最高，可达90%左右，其余2种只占较小比例。

　　从表3中样品②和③的数据可以看出，高浓度醇沉能进一步纯化多糖。但是考虑到95%乙醇的使用量，我们建议不继续进行高浓度的醇沉。

　　对比后文的蛋白质含量，从谱图中可以发现糖蛋白的存在。因其普遍存在于生物细胞中，不易被分离除去，但其含量不高，并不影响应用。接下来的工作可以尝试将糖蛋白分离去除，进一步纯化。

　　2.2 蛋白去除率测定

　　通过凯氏定氮试验[7],测定经65%醇沉的多糖与未经65%醇沉的多糖之间蛋白质含量的区别，前者蛋白质含量为2.45（g/100g），后者为4.85（g/100g），并计算出蛋白去除率为50.52%.同时将经65%醇沉除杂所得多糖水溶，进行Sevage法除蛋白试验，看不到明显的蛋白质层，表明蛋白含量很低。

　　具体结果见表4.对比二者差异，65%醇沉可明显去除蛋白质，而且可不使用有机试剂，大大提高了生产效率，保证无有机残留，为绿色化学在化妆品中的应用 提 供 了 一 定 的 启 示。事 实 充 分 证 明 了65%醇沉除杂的必要性。
　　
　　2.3麦冬提取液防腐挑战试验

　　按照国家标准GB 4789[8]的要求，接种菌种：铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉和实验室收集的杂菌，然后进行相应的检测。样品共2份，分别是提取的麦冬多糖稠膏和浓缩至无醇味后添加防腐剂（质量分数0.1%尼泊金乙酯钠和5%丙二醇）的液体，编号分别为1和2.

　　检验这两个样品的菌落总数及霉菌和酵母菌。当2号样品检验合格后进行防腐挑战试验，接种1mL菌液。结果见表5.

　　表5的检测结果表明：以此工艺条件生产的麦冬多糖，菌含量符合《化妆品卫生规范》对化妆品原料的要求，可以放心地添加于化妆品和保健品中。

　　防腐挑战试验的通过也进一步证实了麦冬多糖浓缩糖浆可以长期存放不变质，满足了化妆品原料的储存和应用需要。因为样品1中大部分都是糖，水分含量低，糖分含量高，而糖的作用跟盐的作用类似，可形成很高的渗透压，一般微生物无法生长，不易变质，故菌含量可符合要求。而样品2中添加了防腐剂，起到了明显的防腐效果，此防腐条件可以作为麦冬多糖水液的应用参考。
　　
　　3 护肤霜配制以及考察

　　3.1护肤霜的制备

　　生产工艺如下：按照配方准确称量A、B组分，分别加热至80℃,保温10min,然后在不断搅拌的条件下将A组分加入到B组分中，继续保温并充分搅拌1min,均质1.5min,然后不断搅拌，降温至50℃后，加入C组分，降温至40℃时加入D组分。

　　3.2试验考察

　　3.2.1理化性质及稳定性按此配方工艺制备的麦冬护肤霜外观自然，呈现细腻的乳白色膏体，有天鹅绒般的质感。根据行业标 准QB/T 1857-2004进 行 理 化 检 验：pH为6.65;在-20℃下耐寒3个月，恢复至常温后，膏体无泛粗、分层等异样；在45℃下耐热3个月，恢复至常温后，膏体无分层。由此可见，此配方稳定性符合行业要求，可以进行工业化生产。

　　3.2.2安全性考察此配方原料均符合《化妆品卫生规范》要求，其生产工艺绿色环保，只用到了食品级乙醇作为分离试剂，充分保证了原料的安全性。人群直接涂抹试用此护肤霜，质感细腻，无任何刺激感。选30人进行人体斑贴试验，均无红斑或丘疹出现。

　　3.2.3功效性考察针对人群试用，采用皮肤测试仪进行保湿性测试，效果显着，不同受试者皮肤均显示有一定程度的改善效果。而且麦冬具有延缓衰老的功效[10],长期使用可明显改善体质。

　　4 结论
　　
　　（1）多糖提取分离方式多样，没有一个简单有效的生产化标准。如刘霞[9]等取麦冬水提液过大孔吸附树脂，用水和70%乙醇洗脱同步提取湖北麦冬总多糖和总皂苷，分离效果很好，但是不适合工业化生产应用。本研究通过一系列试验验证，确立了一个麦冬多糖的工业化生产工艺标准，工艺条件为：麦冬块根先以95%乙醇回流提取4h,烘干后煎煮，料液体积比1∶6,提取3次，每次90min,合并提取液，抽滤除杂后浓缩至黏度为4.6~5.1mPa·s,先以65%醇沉，再以85%醇沉，收集沉淀，烘干粉碎。粉末便于贮存和销售运输，多糖溶液可现用现制。但是鉴于制粉工艺太过复杂，工业化生产可将65%醇沉除杂后的上清液浓缩为3∶1的料液，此时黏度为200mPa·s,pH为4.94,可长期存放不变质。亦可在醇沉除杂后挥去乙醇的溶液中加入适当的防腐剂，制备成相应的溶液，然后进行工业化生产应用。

　　（2）全过程只用到了食品级乙醇作为有机试剂，工业纯水作为提取剂，而且乙醇在后期很容易去除，工艺简单、易操作。此条件生产的原料符合《化妆品卫生规范》[11]和《保健（功能）食品通用标准》[12]要求，可添加到化妆品和保健品中作为功效性物质。麦冬多糖粉末添加于保健品中有养阴生津、润肺清心的功效，此外还有减肥作用。

　　（3）麦冬多糖提取，只要用块根即可，无需粉碎。粉碎不仅耗费大量的物力、财力，而且提取率仅提高1.36%,且后期的抽滤除杂极为耗时，故无需粉碎。

　　（4）此配方生产的麦冬护肤霜实现了全新升级，采用最新的乳化剂，质感细腻、舒爽，采用“中医养颜”理论添加了特有的麦冬提取物，符合现代人的需求。下一步我们会对其具体的功效性进行一系列探讨研究，完善产品各方面的数据。

　　参考文献
　　
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　　[3] 冯怡.一种麦冬多糖提取物在制备具有减肥功能的食品添加剂、保健 品 或 药 物 中 的 应 用：中 国，201110103158.8[P].2012-11-1.
　　[4] 胡坪，乔晚芳，沈骏文，等.麦冬多糖单糖组成的分析方法研究[J].药物分析杂志，2013,33（1）:50-56.
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　　[10]廖慧玲，尹思源，毛樱逾，等.麦 冬抗皮肤衰老作用探讨[J].山西中医，2007,23（3）:53-54.
　　[11]中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范[M].北京：军事医学科学出版社，2007.
　　[12]全国食品工业标准化技术委员会.GB 16740-1997保健（功能）食品通用标准[S].北京：中国标准出版社，1997.