不同类型氟离子荧光探针的研究进展

　　引 言

　　阴离子在很多化学和生物进程中扮演着重要的角色，因此，近来年阴离子的识别和检测受到了极大的关注。其中，氟离子的识别和检测尤为重要。

　　氟是人体所必需的微量元素，适量的氟化物摄入可以预防龋齿，治疗骨质疏松症。但是高浓度的氟化物摄入对人体的危害很大，轻则会影响牙齿和骨骼的生长发育，出现氟化骨症、氟斑牙等慢性氟中毒症状，重则引起心律不齐、恶心、呕吐等急性氟中毒。过量的氟离子对蛋白质和 DNA 的合成都有抑制作用，使得免疫系统代谢紊乱，最终使机体免疫能力下降。过量的氟还会导致动物血压下降甚至贫血，影响动物的生长发育。细胞内的高氟暴露会导致线粒体氧化性损伤，降低线粒体呼吸链速率，从而导致线粒体功能紊乱。

　　传统的氟离子分析方法有离子色谱法、选择电极法、氟试剂比色法和荧光探针法。氟离子荧光探针由于具有选择性、灵敏度高，方便快捷，成本低廉等的优点，被化学研究者大量的设计合成。目前所报道的氟离子荧光探针根据识别机理的不同主要被划分为三种：1）氢键型（Hydrogen bond）；2）路易斯酸受体型（Lewis acid）；3）氢键和路易斯酸混合型（Hybrid Lewis acid/Hydrogen-bond）。

　　本文综述了不同类型氟离子荧光探针的研究进展。

　　1 氢键型

　　由于氟的电负性最强，氟与质子结合形成的氢键最强，甚至可以将质子去掉（即去质子化）。[1, 2]最常见的氢键供体有 N-H 和 O-H 基团，比较典型的氢键结合位点有脲、硫脲[3-5],氨基、酰胺[6-9],吡咯、咪唑及含氮五元杂环化合物[10-17],酚类化合物[18-20]等。这类荧光探针的识别机理是氟离子与探针分子的结合位点质子酸中心形成强烈的氢键或将质子去除，从而使探针分子的光物理性质发生变化，通过荧光信号或者颜色变化表达出来。

　　1.1 脲、硫脲类

　　彭孝军课题组在 2006 年设计合成了一例以脲为氟离子识别位点，苯并恶唑为荧光母体的氟离子荧光探针 1[3]（如图 1.1）。加入氟离子后，探针的脲结合位点先与一倍当量的氟离子形成氢键，随着氟离子浓度的增加，进一步夺取 N-H 的氢质子，形成氮负离子和 FHF-,抑制了激发态分子内质子转移（ESIPT）过程。探针颜色从无色变成黄色，荧光从橘黄色变成绿色，实现了对氟离子的裸眼以及荧光比率识别。该探针加入醋酸根离子后，荧光从橘黄色变成蓝色，能够很好的区分氟离子和醋酸根离子。Gunnlaugsson 等人报道了一例以萘酰亚胺为母体，在 3 位上引入尿素作为识别基团的氟离子荧光探针 2[5]（如图 1.2）。在纯 DMSO 体系中，随着加入氟离子浓度的增加，紫外吸收在波长为 327nm 处的强度迅速增加，272 nm 处的强度降低，在495 nm 处出现一个新的吸收峰，吸收光谱的这些变化使得探针的颜色从浅黄色变成红色，实现了对氟离子的裸眼识别。与此同时，探针的荧光强度随着氟离子浓度的增加而降低，当加入 50 倍当量的氟离子时，荧光基本被完全淬灭。这是由于加入氟离子后，氟离子与尿素的 N-H 形成氢键，进而发生去质子化作用，使得探针发生分子内电荷转移（ICT）过程，从而探针荧光被淬灭。

　　Ramamurthy 等人设计合成了一例以硫脲和亚胺基为双重识别基团，吖啶二酮衍生物为荧光母体的氟离子比色荧光探针 3[4]（如图 1.2）。在乙腈体系中，加入的氟离子浓度小于 0.4 mM 时，氟离子与硫脲的 N-H 形成氢键然后去质子化，此时探针发生光诱导电子转移（PET）进程，荧光被淬灭，颜色无变化。当加入氟离子浓度大于 0.4 mM 时，氟离子与吖啶二酮衍生物上的亚氨基 N-H 形成氢键然后去质子，探针的 PET 进程阻断，分子内形成一个强的电子拖拉体系，发生分子内电子转移（ICT）进程。这些变化表现在光谱上为最大吸收波长从 370 nm 红移至 460 nm,最大荧光发射波长从 420 nm 红移至 500 nm,且从荧光淬灭变成了荧光增强。
　　
　　1.2 氨基、酰胺类

　　Wang 等人报道了一例近红外可视化比率识别氟离子的荧光探针 4[9]（如图 1.3）。该探针以二苯亚胺上的 N-H 作为氟离子的识别基团，分子本身存在着激发态分子内质子转移（ESIPT）现象，在波长为 671 nm 处有较弱的荧光。在 DMSO 体系中，加入氟离子，与亚氨基 N-H 形成氢键，发生去质子化作用，抑制了探针分子的 ESIPT 进程。

　　探针在 671 nm 处的荧光强度降低，在 478 nm 处出现一个很强的荧光发射峰，实现对氟离子的比率检测，同时紫外吸收光谱上在 709 nm 处出现一个新的吸收峰，探针颜色从橘红色变成深蓝色，实现对氟离子的近红外可视化识别。探针 4 对氟离子的最低检测限可以达到微摩尔级别。Prasad 课题组设计合成了一例低分子量荧光有机凝胶氟离子探针 5[6]（如图 1.4）。该探针是AB3型树枝石低分子量有机凝胶苯乙酰腙和蒽在氯仿和甲醇（v/v = 1:1）混合溶液中常温搅拌 1 个小时而制成的及时凝胶，酰腙的 N-H 作为氟离子的识别位点，蒽是荧光发色团。加入氟离子之前，探针成黄色凝胶状态。而加入氟离子后，氟离子与酰腙的 N-H 形成氢键，发生去质子化作用，探针经历一个从凝胶到溶液转变的过程，颜色从黄色变为亮红色，可裸眼识别 0.1 倍当量（相比于凝胶浓度）的氟离子。在红色溶液中加入适量的水，探针又可从红色溶液状态转变为黄色的凝胶状态，因此，探针 5 对氟离子的响应是个可逆的过程，可循环使用。

　　1.3 含氮的五元环化合物类

　　彭孝军课题组 2005 年报道了一组比色和比率识别氟离子的荧光探针 6、7 和 8[14]（如图 1.5）。

　　该组探针均以 1,2-咪唑蒽醌为荧光母体，咪唑的N-H 为氟离子的结合位点。在乙腈溶液中，探针 6和 8 对氟离子具有很好的响应，吸收和荧光发射光谱均有 100 nm 的红移，且都有非常明显的荧光比率变化（Rmax/Rmin= 88 和 548），而 7 仅吸收有变化，荧光无响应。在基态时，加入氟离子发生了两个过程，先是氟离子和 N-H 形成氢键，然后再发生去质子化作用。在激发态时，分子内的质子转移（ESIPT）也促进了去质子化过程的发生。探针对氟离子的选择性主要被分子内的电子推拉体系所控制，探针 6 对氟离子的选择性最好，可以把氟离子和醋酸根、磷酸二氢根区别开，因为探针 6 的N-H 基团酸度比较适宜。Ravikanth 课题组报道了一例以 BODIPY 为荧光母体，可逆再循环使用的高选择性氟离子化学探针 9[15]（如图 1.6）。探针分子内部的 N-H 可以和BODIPY 上的两个氟原子之间形成氢键，使得苯并咪唑与 BODIPY 处于同一个平面上，PET 过程被抑制，具有很强的橘黄色荧光。在乙腈体系中，加入氟离子后，氟离子可竞争性的与 N-H 形成氢键，进而诱导去质子化作用，使得苯并咪唑负离子与BODIPY 不在同一平面上，从苯并咪唑到 BODIPY的光诱导电子转移（PET）过程得以发生，从而探针本身很强的荧光被淬灭，探针的颜色也从粉红色变成蓝色。如果在加入氟离子的探针溶液中滴加少量的酸，探针的荧光会逐渐得到恢复，且探针颜色也从蓝色变回粉红色，说明该探针检测氟离子是一个可逆的过程，可以进行循环使用检测氟离子。该探针对氟离子的最低检测限为 93 nM.
　　
　　1.4 酚类化合物

　　四川大学 Lu 等人报道了一例高选择性的氟离子荧光探针 12[18]（如图 1.8）。该探针以萘酰亚胺为荧光母体，酚羟基 O-H 为氟离子识别位点。

　　在纯 DMSO 体系中，加入氟离子，氟离子与酚羟基形成氢键，并发生去质子化过程，探针的最大吸收波长红移了 214 nm,到了近红外区域，溶液从黄色变成蓝色，同时荧光被很快淬灭，从橘红色荧光变为无荧光。探针对氟离子具有较快响应速度，荧光强度在加入氟离子 15 秒内被基本淬灭，对氟离子的最低检测限为 14.2 μM.由于在细胞内探针的荧光强度不能被氟离子淬灭，因此不能用来检测细胞内的氟离子，但可用作溶酶体的标记染料。

　　南方医科大学的 Liu 等人报道了一例基于 6-羟基萘-2-氰基丙烯酸聚乙二醇酯的氟离子荧光探针 13[20]

　　（如图 1.9）。在 PBS（pH 7.4,10 mM,包含 1 % DMSO）缓冲溶液体系中，加入氟离子，探针在 490 nm 处的荧光强度降低，450 nm 处的荧光强度增加，荧光从绿色变成蓝紫色。与此同时，在波长 382 nm 处的紫外吸收降低，548 nm 处出现一个新的吸收带，红移了 166 nm,颜色从无色变为粉红色。13 对氟离子具有高选择性，不受其他离子干扰，可检测无机氟离子（即 NaF），最低检测限为 8.54 μM.13 具有较好的水溶性和细胞渗透性，且细胞毒性很小，可用于识别细胞内的氟离子。
　　
　　2 路易斯酸受体型

　　路易斯酸（Lewis acid）是指能作为电子对接受体（Electron pair acceptor）的原子，分子，离子或原子团，有机化学反应中作为亲电试剂。路易斯酸具有低能量的 LUMO 空轨道（最低未占轨道），会与路易斯碱的 HOMO（最高占有轨道）反应。常见的路易斯酸配位中心有金属原子（如 Sb,Zn,Cu,Zr,Al 等），非金属原子 B、Si 等。氟离子是一个典型的路易斯碱，因此，可以利用路易斯酸碱反应原理来设计合成一系列的氟离子荧光探针。目前所报道的路易斯酸受体型氟离子荧光探针主要以下几类：有机硼化合物类[21-24]、硅氧键类[25-34]、硅碳键类[35-39]、硅氧键断裂诱导分子内成环反应类[40-48]以及金属络合物类[49-51].

　　2.1 有机硼化合物类

　　Yoon 等人在 2006 年报道了第一例以荧光素为荧光母体，硼酸作为识别位点的氟离子荧光探针14[22]（如图 1.10）。探针 14 的硼原子可与酚羟基上的氧进行配位，形成硼酸盐化合物。探针分子发生从硼酸盐到荧光素的 PET 过程，荧光被淬灭。

　　在乙腈与甲醇体积比为 9:1 的混合体系中，加入氟离子后，氟离子迅速与硼原子进行配位，硼原子上的羟基离去，荧光素上的酚羟基与氟离子，临近的氮原子之间形成氢键，此时探针分子的 PET 进程被抑制，荧光恢复。2009 年 Yoon 课题组又设计合成了一例比率荧光识别氟离子的荧光探针 15[24]（如图 1.11）。

　　该探针包含一个不对称双配位基团，即一个硼酸基团和一个咪唑鎓盐基团。在乙腈溶液中，探针 15有一个很宽的荧光发射带，最大发射波长在 440nm.加入氟离子后，440 nm 的发射峰有明显的下降，在 372 nm 处出现一个很强的新发射峰，等发射点在 406 nm.这是由于氟离子与硼酸基团的硼原子发生路易斯酸碱反应形成配位键，同时氟离子还与咪唑鎓盐上的 C-H 形成氢键。
　　
　　2.2 硅氧键类

　　朱为宏课题组 2012 年报道了第一例能够同时比色和比率识别氟离子的近红外荧光探针 16[25]（如图 1.12）。该探针以 BODIPY 衍生物为荧光母体，硅氧键为氟离子识别基团。在二氯甲烷体系中，加入氟离子，探针的颜色从粉红色变成靛蓝色，可实现对氟离子的裸眼比色识别。探针本身在 573nm 处发射黄色荧光，加入氟离子后，573 nm 处的发射强度降低，在 676 nm 处出现新的荧光发射峰，实现了对氟离子的比率荧光识别。同年，该课题组又报道了一例以苯并吡喃腈衍生物为荧光母体的近红外氟离子荧光探针17[26]（如图1.12）。在DMSO和水（体积比为 95:5）的混合体系中，探针为黄色溶液，无荧光，加入氟离子后，探针颜色变为蓝色，并在波长为 718 nm 处发射出荧光。加入其它阴离子，均不会发生一系列的光谱变化，探针对氟离子具有较好的选择性，最低检测限为 8.5×10-8M.北京大学的 Tang 课题组 2014 年报道了一例能够检测水溶液和细胞内氟离子的超灵敏度荧光探针 18[28]（如图 1.14）。该探针中包含着一个四级胺结构，既能增加探针的水溶性，又能通过电荷相互吸引将氟离子锁在探针分子周围，大大提高了探针对氟离子的选择性和灵敏度，还能增加探针的细胞渗透能力。探针能快速响应纯 PBS 缓冲溶液中的无机和有机的氟离子（NaF、TBAF），在 2 分钟内荧光强度基本达到稳定，最低检测限为 0.57ppm.另外，探针 18 还能比率识别 Hela 细胞中的氟离子。台北国立科技大学的Huang 等人2015年报道了一例超灵敏的“off - on”型氟离子荧光探针 19[31]（如图 1.15）。该探针以香豆素为荧光母体，叔丁基二苯基硅为氟离子识别位点。探针本身荧光被淬灭，加入氟离子（NaF），氟离子诱导硅氧键断裂，形成羟基，进而分子内部发生一系列的电子重排反应，释放出一个醌甲基结构，同时分子中二氟甲基的两个氟离子也相继离去，最终形成 7-羟基-8-醛基香豆素，荧光恢复。而离去的两个氟离子会继续进攻探针，诱发分子内的重排反应。在碱性蛋白胨水（APW）溶液中，探针对氟离子的最低检测限为 0.5 pM,是目前所报道的氟离子探针中检测限最低的。但是由于加氟后要发生一系列的化学反应，导致了探针对氟离子的响应时间较长，文章中的各项测试实验响应时间均在 1 h 以上。
　　
　　2.3 硅碳键类

　　Ravikanth 等人设计合成了一例以 BODIPY 为荧光母体，基于硅碳键断裂反应的氟离子荧光探针20[33]（如图 1.16）。在二氯甲烷体系中，加入氟离子，氟离子诱导 断裂，形成终端炔烃。在光谱上表现为最大吸收波长兰移 20 nm,颜色从红色变成紫色，即吸收光谱波长 571 nm 处的吸收强度减弱，在波长 551 nm 处出现一个新的吸收峰；最大发射波长也蓝移 20 nm,荧光从橘黄色变成了绿色，即波长 584 nm 处的荧光发射峰强度逐渐减弱，在波长 564 nm 处出现一个新的发射峰。

　　探针对氟离子的响应较快，在 5 分钟内达到平衡。

　　因此，该探针可实现对氟离子的比色裸眼和比率荧光识别。

　　武汉大学的 Liu 课题组也报道了一例非常类似的氟离子荧光探针 21[38]（如图 1.17）。在丙酮体系中，加入氟离子后，探针的最大吸收波长从 555nm 蓝移到 538 nm,而最大发射波长也从 571 nm蓝移至 554 nm.探针对氟离子具有很好的选择性，基本不受其他阴离子的干扰，对氟离子的最低检测限为 67.4 nM.但是探针 20、21 都只能检测纯有机溶剂中的氟离子，在有机溶剂中稍微加水溶液对氟离子都没有响应。2.4 硅氧键断裂诱导分子内成环反应类Ahn 等人报道了一例可用于体内双光子荧光成像的氟离子荧光探针 22[40]（如图 1.18）。在HEPES 的缓冲溶液中（包含 20%的乙腈），探针 22的最大吸收波长在 460 nm,本身没有荧光，加氟离子后，10 分钟即可观察到在波长 595 nm 处出现一个强的荧光发射峰，1 小时后荧光强度基本达到饱和，对氟离子的最低检测限为 4 ppm.探针 22具有很好的双光子性质，可用来进行单、双光子细胞荧光共聚焦显微成像。作者将该探针应用于活的斑马鱼组织双光子荧光成像，第一次实现了对脊柱动物组织内的氟离子识别。彭孝军课题组 2014 年报道了一例点亮细胞线粒体中氟离子的荧光探针 23[48]（如图 1.19）。在乙腈体系中，探针对氟离子具有很好的选择性和很高的灵敏度，响应时间较快（10 分钟内达到饱和），具有很高的荧光量子产率（Φ = 0.8396），容易制成试纸用于识别纯水中的氟离子，最低可检测到19 ppb.23 首次点亮了活细胞线粒体中的氟离子，最低能识别细胞内 10 μM 的氟离子，而不受到其他阴离子的干扰。2.5 金属络合物类Gabbai 课题组在 2012 年报道了一例含有过渡金属锑络合物的氟离子荧光探针24[49]（如图1.20）。

　　由于过渡金属 Sb 具有接受外来电子对的空轨道，是一个很好的路易斯酸配位中心，前人工作发现[Ph4Sb]+对氟离子具有很高的亲和力。因此，该文作者基于此设计合成了一例包含 [Ph4Sb]+结构的氟离子荧光探针，探针中蒽作为荧光发色团，Sb作为氟离子的识别位点。在水（10 mM,CTAB/吡啶缓冲液）和 DMSO（体积比 9:1）混合溶液中，探针本身没有荧光，加入氟离子，氟与 Sb 配位，形成[Ph4Sb]F,发射出蓝紫色荧光。2014 年 Gabbai 课题组在探针 24 的基础上又报道了一例包含过渡金属锑 Sb 络合物的氟离子荧光探针 25[50]（如图 1.21），该探针可检测到饮用水中 ppm 级别的氟离子浓度。在二氯甲烷中，探针的最大吸收波长在 430 nm,无荧光发射，加入氟离子后，最大吸收波长红移至 482 nm,并在波长616 nm 处出现一个很强的荧光发射峰，探针颜色从黄色变成了橘红色，从没有荧光变成发射很强的橘红色荧光。该探针可裸眼检测到 mM 级别的氟离子浓度，在二氯甲烷中加入相转移催化剂TPABr,可用于识别饮用水中的氟离子，能够识别到饮用水中 1.9 ppm 的氟离子。

　　3 氢键和路易斯酸混合型

　　有的氟离子荧光探针分子中同时存在两个不同类型的氟离子识别位点，即既有氢键类型的氟离子结合位点，又有路易斯酸氟离子配位中心，统一将这一类探针称为氢键型和路易斯酸混合型氟离子荧光探针。

　　James 等人设计合成了一例以 1,8-萘酰亚胺为荧光母体的氟离子荧光探针 26[52]（如图 1.22）。该探针包含两个氟离子识别位点，一个是氨基的N-H,另一个是硼酸酯基团。在探针的乙腈溶液中，加入氟离子，探针在 448 nm 处的最大吸收峰减弱红移至 470 nm,同时在波长 590 nm 处出现一个强的新吸收峰，探针颜色从黄绿色变成了蓝紫色。随着氟离子浓度的增加，探针的荧光逐渐被淬灭。作者通过 Job's plot 实验证明了探针与氟离子之间的配比关系为 1:5,分别是 3 个氟离子和硼（B）原子形成配位键，2 个氟离子和氨基上的 N-H 形成氢键，进而发生去质子化作用。由于醋酸根和磷酸氢根也可以和 N-H 形成氢键，探针对这两种阴离子也具有一定的响应。
　　
　　4 总结与展望

　　目前所报道的氟离子荧光探针主要有两种类型，即氢键型和路易斯酸型。大部分的氢键型氟离子荧光探针由于氟离子与水分子之间能够形成氢键，限制了其在水溶液中的应用，而且容易受到醋酸根和磷酸氢根的干扰。而路易斯酸型的氟离子荧光探针是利用路易斯酸碱反应原理来检测氟离子，对氟离子具有专一选择性，其中很多都具有较好的生物相容性，可以应用于检测生物体内及细胞内的氟离子。由于造成体内氟中毒的主要原因是长期处于高氟环境中或是长期饮用高氟水，所以当前和未来研究氟离子荧光探针的聚焦点应该在于开发能识别水溶液和细胞内氟离子的新型荧光探针。从荧光探针的类型来看，路易斯酸型氟离子荧光探针将成为未来氟离子荧光探针的主要发展方向。