植物学论文
植物育种学论文热门推荐范文10篇之第九篇：探究分子生物技术在植物育种中的应用前景
摘要：近年来分子生物学和生物技术的快速发展促成了一批在育种中具有重要应用前景的新型植物育种技术。重点介绍了位点特异性诱变、同源转基因、转基因阴性诱导系选育、农杆菌浸润和转基因砧木嫁接五类新型植物育种技术， 探讨了研发产品能否归类于转基因生物产品及其监管等方面的焦点问题， 梳理了国外在健全相关监管体系方面的做法， 并针对这些问题提出符合我国国情的发展建议。
关键词：新型植物育种技术； 转基因生物； 监管现状；
Abstract:
In recent years, the rapid development of molecular biology and biotechnology has spawned a number of new type plant breeding techniques with important application prospect. The paper mainly introduced 5 new plant breeding techniques, including site specific mutagenesis, cisgenesis/instragenesis, breeding with transgenic inducer line, agro-infiltration techniques and GM rootstock grafting, and also discussed the focus issues on whether new products generated with these new plant breeding techniques could be classified as GMO and how could they be effectively regulated by the governments in detail. The paper also sorted out common practices conducted abroad in optimizing the relevant supervision systems, and put forward suggestions suitable in China realistic condition.
Keyword:
new plant breeding techniques; genetically modified organisms; supervision status;
分子生物学和生物技术近年来的飞速发展为植物育种提供了巨大的机遇， 也使可快速选择或产生目标性状的新技术不断被发掘和利用。这些新型植物育种技术 （new plant breeding techniques, NPBTs） 的共同特征表现在将遗传修饰 （大多数情况下利用农杆菌作为载体） 作为育种过程的一部分， 以对目标性状进行改良， 并且大部分技术产生的最终产品中不含外源的转基因元件。与常规育种技术相比， 新型育种技术更具特异性和针对性， 大大提高了传统育种的效率和精确度[1].因此， 这些技术在商业化育种中具有重要的应用前景， 并在全球尤其是欧美地区快速发展。
然而， 由于新型植物育种技术在育种中间过程涉及了转基因技术， 目前各国对于这些新技术产生的生物体是否受转基因生物法规的监管仍存在分歧， 这对现有生物安全监管体系提出了新问题和挑战。欧盟[2,3]、荷兰[4,5,6,7,8]、英国[9]、奥地利[10,11]、澳大利亚[12]、南非[13]的多个机构相继发布报告， 分析了新型植物育种技术发展应用前景及潜在风险和监管要求， 并重点围绕新型育种技术产品是否属于转基因产品、新技术与产品的风险评估及监管等问题进行了探讨。目前， 我国新型植物育种技术发展迅速， 科研人员已陆续将同源转基因[14,15]、智能不育系制种[16,17]和基因编辑[18,19,20]等多种新型植物育种技术应用于植物基础研究中。随着新技术及其成果在育种中的应用， 我国也会面临新育种技术如何监管等问题。鉴于此， 本文主要分析了新型育种技术相关的研究进展， 并梳理相关国家对于这些技术的监管措施， 以期为我国相关领域的研究人员及决策者提供参考。
1 新型植物育种技术的种类及特点
相比随机突变的常规育种技术， 新型植物育种技术更具特异性和针对性， 它能通过在特定位置插入、敲除或替换DNA以及在保持DNA序列不变的情况下控制基因的表达等方式， 精确改变基因组特定位点的遗传信息[1].新型植物育种技术与转基因技术有类似的特征， 但严格来说两者又并不完全相同。比如许多新型植物育种技术中的转基因载体只是瞬时出现或只出现在育种的中间过程， 新技术能够通过在指定位置插入基因， 减少由于随机插入导致的不可预知表达等问题。
根据技术作用机理及产生的效果， 目前在植物育种中具有应用前景的新型育种技术共有五大类[2].
第一类为位点特异性诱变技术 （site specific mutagenesis） , 包括寡核苷酸定向诱变 （oligonucleotide-directed mutagenesis, ODM） 和定点核酸酶技术 （site-directed nucleases, SDNs） .其中， 定点核酸酶技术又包括巨核酶技术 （meganucleases, MN） 、锌指核酶技术 （zinc-finger nucleases, ZFN） 、转录激活因子样效应物核酸酶技术 （transcription activator-like effector nuclease, TALEN） 以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated cas system, CRISPR/Cas） .ODM可通过细胞自身的修复机制， 对植物基因组中同源序列进行位点特异性的核酸替换、插入或删除。定点核酸酶技术通过非同源末端连接或同源重组方式对特异位点进行修复， 从而使植物基因组产生碱基突变、核苷酸缺失/插入。根据其用途， 定点核酸酶技术进一步划分为SDN-1、SDN-2和SDN-3三类[21].SDN-1通过非同源末端连接修复 （DNA修复过程） 产生一个或几个碱基的位点特异性突变或短缺失/插入突变；SDN-2通过同源重组修复 （基因修复机制） 产生位点特异的点突变；SDN-3可在预期位点定向插入长DNA片段。目前位点特异性诱变技术主要应用于模式植物和农作物的基础研究， 以获得耐除草剂性状及提高抗病性。相关技术尤其是巨核酶和锌指核酸酶已被用于加速玉米、油菜和马铃薯新品种的培育[22].
第二类为同源转基因技术， 包括cisgenesis和intragenesis.与常规转基因技术的供体DNA可来源于任何生物不同， 同源转基因技术的供体DNA来自于杂交亲和的物种。在cisgenesis中， 供体DNA序列包含了插入基因自身的启动子、内含子和终止子等元件；而在intragenesis中， 可在体外对相同物种或杂交亲和物种的不同基因遗传元件进行重组， 从而产生各种新的基因组合。两种技术都会使最终产品中含有稳定整合的同源DNA序列。目前该技术已被广泛应用于多种作物的品种改良， 高淀粉马铃薯、抗晚疫病马铃薯、抗黑星病苹果、高植酸酶活性大麦和加工品质改良的马铃薯5个新品种已被批准开展大田试验；高淀粉马铃薯和低丙烯酰胺马铃薯2个品种已分别向欧盟和美国递交了解除转基因监管的申请[23].
第三类为转基因诱导系选育技术 （breeding with transgenic inducer line） , 包括RNA依赖的DNA甲基化 （RNA-dependent DNA methylation, RdDM） 、反向育种 （reverse breeding） 、早花诱导加速育种 （accelerated breeding following early flowering） 和杜邦先锋雄性核不育制种 （seed production technology, SPT） 技术。该类技术在育种中间过程会利用到转基因技术， 但是会通过常规育种方法剔除选育过程中转入的外源基因， 因而其最后的商业化品种中不含任何遗传修饰相关的外源DNA序列。在Rd DM技术中， 通过转入与目标基因启动子区域同源的RNA编码基因， 诱导靶基因启动子区域甲基化， 并通过抑制靶基因的转录引发基因沉默。反向育种技术是利用RNA干扰技术抑制植物减数分裂重组来以快速获取纯合亲本系， 有助于培育杂种F1, 使得植物杂种优势能够稳定遗传。早花诱导加速育种技术主要是通过转入与开花时间相关的基因创制可诱导植物提前开花的转基因系来开展育种。杜邦先锋SPT技术的原理是将花粉育性恢复基因、花粉失活 （败育） 基因和标记筛选基因作为紧密连锁的元件， 导入隐性核雄性不育突变体中， 获得核雄性不育突变体的保持材料， 最终用于生产制种。目前， SPT技术已成功应用于玉米育种， 并于2011年被美国农业部解除了转基因管制审批[24].
第四类为农杆菌浸润技术 （agro-infiltration techniques） , 包括狭义的农杆菌浸润和农杆菌注射。狭义的农杆菌浸润主要研究局部基因定位表达， 农杆菌注射主要是研究目标基因在整个植株中的表达和扩散， 前者将叶片浸润于非复制型载体的农杆菌悬浮液中， 后者则是将叶片浸润于含有病毒载体的农杆菌悬浮液中。该技术应用较为广泛， 可应用于基因功能、评价基因敲除影响以及生产重组蛋白。其中农杆菌浸润技术主要应用于模式植物烟草的基础研究， 同时也培育出一些马铃薯、油菜和莴苣的抗病品系[22].
第五类为转基因砧木嫁接技术 （GM rootstock grafting） .该技术是将非转基因接穗嫁接在具有改良特性的转基因砧木上 （如根系能力改善、抗土传病害） , 而果实或花由非转基因植株部分所产生。转基因砧木嫁接技术主要应用于果树、蔬菜等作物育种中， 同时也是一种研究大分子迁移和基因沉默及表达的有效工具。目前该技术已培育出生根能力强的苹果和梨、抗扇叶病葡萄、抗疫病柑橘和株型改善的枳橙等新品种， 并在欧盟申请了大田试验[22].
2 新型植物育种技术监管面临的问题与挑战
2.1 新型植物育种技术育成的产品是否属于转基因生物
随着技术的演进与发展， 新型植物育种技术与常规转基因技术之间的概念边界不再如从前般清晰， 对转基因生物法律概念、定义的理解也随着技术的进步而不断深化发展， 从而导致难以确定新型育种技术的商业化产品是属于转基因还是非转基因。世界主要国家开展的政府监管措施也存在较大差异， 全球贸易市场也并未达成一致意见。因此， 新技术是否带来遗传改变、利用新技术培育的植物和产品是否属于转基因生物立法的监管范围等问题是目前争论的焦点。
2.2 如何评估新型植物育种技术引发的潜在风险
新型植物育种技术近年来呈活跃发展态势， 但尚未进入技术的成熟与稳定阶段， 学术界对这类技术研发使用的社会效益尚未达成共识， 尚不清楚是否存在一定的负面影响 （如人体健康、环境保护等） , 因此如何评估可能存在的风险已成为业界关注的焦点之一。目前， 一般认为新育种技术的管理可以借鉴转基因作物的评估管理法律法规与技术手段， 但是也有不同观点提出， 更多的应聚焦在技术过程与最终产品的关系上， 认为要以有力可靠的事实证据为基础来评估新技术产品可能出现的各项潜在风险， 而不是关注新型技术本身及其中间品系等过程性问题[25].
2.3 如何识别和检测新型植物育种技术产品
新技术的发展也对目前的检测技术提出了挑战。大多数新技术育成的产品中不含插入的外源基因， 这使得产品中的遗传改变不能被当前的方法所检测；或者利用新技术引入的突变和自然产生的突变一样， 无法将其与常规诱变技术获得的性状进行区分。因此， 现实中难以对此类商品进行检查和标识， 这将会影响相关法律法规的强制执行效率。
3 国外有关新型植物育种技术的监管
全球对新型植物育种技术的特点及影响缺乏认识， 对于其监管尚未形成统一的意见。近年来， 欧盟及其成员国、美国、澳大利亚、新西兰、加拿大、南非等国围绕新型植物育种技术及其监管分类展开了深入的讨论， 并采取相关措施逐步健全监管体系。
3.1 欧盟及其成员国
2007年欧盟委员会成立了新技术工作组对各种新育种技术是否等同于遗传修饰技术进行评估， 2010年欧盟委员会委托联合研究中心 （Joint Research Center, JRC） 对当前新型植物育种技术的应用进行分析[2], 同时委托欧洲食品安全局 （European Food Safety Authority, EFSA） 评价这些新技术产生的植物是否属于目前欧盟转基因产品立法范围内， 其研究结果表明同源转基因与常规育种技术具有类似的潜在风险[26,27].
多个欧盟成员国也纷纷发布一系列报告对新型植物育种技术进行探讨。荷兰遗传修饰委员会、比利时生物安全咨询理事会、英国环境释放咨询委员会、德国联邦消费者保护与食品安全局已经将相关的分析结果呈递给欧盟委员会。2014年10月， 英国生物技术和生物科学研究理事会 （Biotechnology and Biological Sciences Research Council, BBSRC） 针对新型作物遗传改良技术发表立场声明， 并认为欧盟对作物新品种的监管体系存在局限性， 因为转基因与非转基因技术之间的界限也将随着技术的发展越来越模糊， 建议欧盟对于新技术采用基于作物性状而非生产技术的监管体系[28].2015年2月， 欧洲植物科学组织 （European Plant Science Organisation, EPSO） 发表了一份《作物遗传改良技术》的声明， 认为目前欧洲立法没有对作物遗传改良新方法和相关生物产品产生积极影响， 要求欧盟委员会根据新技术工作组的建议尽快提供一份新型育种技术相关的指导文件[29].2015年11月， 瑞典农业部针对于默奥大学和乌普萨拉大学学者提出的CRISPR技术开发的产品是否属于转基因生物的问题作出明确解释， 即：利用CRISPR-Cas9技术进行基因组编辑所获得的不含外源DNA的拟南芥突变体不属于转基因生物[30].
2018年， 欧洲法院裁定基因组编辑作物属转基因， 包括CRISPR基因组编辑等在内的诱变技术在欧洲将接受与转基因技术一样的监管， 其原因是基因诱变以天然不会发生的方法修改了生物的遗传物质[31].然而， 包括欧洲植物科学组织、欧洲种子协会等多个科学团体认为该裁定在科学上毫无根据， 将给欧洲植物研究和农业发展带来负面影响。
3.2 美国
自1986年以来， 美国先后发布了《生物技术监管协同框架》、《新兴技术监管和监督原则》等多项办法， 明确了生物技术及其产品的管理办法和管理机构， 即分别由农业部 （United States Department of Agriculture, USDA） 、环境保护局 （Environmental Protection Agency, EPA） 和食品药品管理局 （Food and Drug Administration, FDA） 三家机构共同负责制定生物技术法规框架， 确保这些产品对环境和人类安全。其中， USDA着重于保护作物安全， FDA监督食品和饲料安全， EPA则负责管理农药的销售和测试。
对于近年来出现的许多新技术及其产品， 美国仍然沿用现有法律进行监管。自2004年以来， USDA基于个案分析原则， 解除了多种新型育种技术或相关品种的监管， 例如， Cibus公司的基因定向诱变技术、陶氏益农利用锌指核酸酶技术获得的耐除草剂玉米、杜邦先锋DP-32138-1保持系、阿巴拉契亚水果研究站利用FasTrack促进提早开花技术获得的李树、内布拉斯加大学林肯分校利用表观遗传学技术获得的高粱、宾夕法尼亚大学的基因编辑防褐变蘑菇等[32].2018年USDA部长发布声明， 认定"基于基因组编辑农作物与其他传统育种方法培育的产品实质等同， 遗传物质的删除、单碱基的替换， 以及亲缘关系相近的物种之间遗传物质的渗入均不在传统法案监管范围内"[33].此外， FDA也正在开展基因编辑技术生产食品和饲料用新植物品种征求意见工作， 以便为后续厘清基因编辑产品的管理政策提供参考。环境保护局 （EPA） 在考虑豁免同源转基因技术所获得的植物审查过程[23].
3.3 其他国家
目前， 澳大利亚基因技术管理办公室并未对特定的新技术公布一个一般性的指导文件， 而是当特定技术出现监管地位不明确时鼓励开发者联系他们。该机构已经几次对新型育种技术相关的法律条文解释给予了建议， 如利用锌指核酸酶 （ZFN-1） 技术培育的作物可能被视为非转基因生物。2012年澳洲新西兰食品标准管理局 （Food Standards Australia New Zealand, FSANZ） 召开了一个专家组会议， 对6种新型育种技术生产的产品是否应被划分为转基因生物进行讨论。专家组认为通过同源转基因、锌指核酸酶 （ZFN-3） 、转基因砧木嫁接等技术获得的食品应被归为转基因食品；利用定向诱变技术和SPT技术获得的食品为非转基因食品；而对于反向育种技术尚无定论[12].
加拿大对生物技术产品监管采用基于产品的管理模式， 并在《生物技术监管框架》中明确了适用于生物技术产品的原则。加拿大将继续沿用其法律进行监管， 并将生物技术产品作为"新产品"对待， 监管的原则是产品的新性状 （植物新性状、新饲料和新食品） 而不是采用的技术[3].同时， 对于新性状的评价是基于科学的证据和遵循逐案的原则。因此， 在加拿大， 不管育种过程中使用何种技术， 只要作物拥有新性状 （PNTs） 就必须通过安全评估和授权过程。目前， 加拿大这种以作物性状而不是育种技术为基础的监管体系被认为是更加符合新技术发展的要求。
南非是仅有的几个种植商业化转基因作物的非洲国家之一。受南非科技部委托， 南非科学院 （Academy of Science of South Africa, ASSAf） 发表了《新育种技术的监管》的报告[13], 对新型植物育种技术的潜在价值、生物安全影响和监管进行评估分析。报告认为， 南非有一套健全和经验丰富的转基因生物管理系统， 该监管体系无需进行大调整就能有效地监管这些新技术产品， 并且生物安全风险评估的对象应该是基因组发生改变的生物体 （产品） 而不是引发这些变化的过程或技术。
阿根廷是全球唯一一个颁布了官方新育种技术监管框架的国家[34], 并认为"新组合的遗传物质"是判断新育种技术产品是否被归为转基因生物的关键点。其中， 通过cisgenesis、intragenesis、SDN-3和合成生物学等技术获得产品归为转基因生物；转基因嫁接砧木整个植株视为转基因作物；被证实剔除外源物质的SDN-1、SDN-2和反向育种技术产品可认为是非转基因产品；表观遗传修饰技术不会产生"新组合的遗传物质", 但某些情况中的DNA插入片段需要被剔除；ODM产品为非转基因生物；农杆菌浸润的监管应聚焦在转基因微生物上。
4 启示与建议
4.1 构建适合我国国情的新型植物育种技术监管和安全评估体系
目前， 我国新型植物育种技术发展迅速， 定点诱变、同源转基因、转基因砧木嫁接等多种新技术陆续应用于基础研究领域。但由于我国尚未对新型植物育种技术及产品是否属于转基因生物给予明确定义， 在不久的将来我国将会面临监管制度无法适应技术发展的问题。因此， 新型植物育种技术及产品安全评估与监管应引起政府部门高度重视。一是建立新型植物育种技术监管体系。结合我国现阶段基本国情， 借鉴国外先进管理经验， 探索建立基于科学事实、制度明晰的植物育种技术监管体系， 促进新技术的快速发展与合理应用， 同时保障生物安全和社会稳定。二是构建新型植物育种技术安全评估体系。鉴于国际上对新型植物育种技术及其产品的认识存在争议， 我国在这类技术的研发和管理上应保持"大胆研究、谨慎推广、严格监管"的工作态度， 构建全面、高效的新型植物育种技术的安全评估体系， 对技术研发应用过程和产品进行严格评估。
4.2 加强新型植物育种技术监管的国际沟通与交流合作
近年来， 新型植物育种技术的发展方兴未艾， 取得了许多重大突破。由于这类技术与转基因技术之间的界定不清， 国际上在是否需要对其进行严格监管的问题上仍无法定论。目前， 部分发达国家逐步探索形成新型植物育种技术监管体系， 这些国际经验的形成过程和经验本身具有极大的学习和借鉴价值。因此， 我国应加强植物育种技术的国际合作， 积极谋划介入国际育种监管体系。一是在新型植物育种技术领域加强与发达国家的合作交流， 充分了解各国在该领域的前沿发展和管理动态， 综合借鉴和吸取国际先进经验与发展思路。二是积极参与国际社会植物新品种规则的制定， 助力完善国际监管体系， 并为未来在制定全球统一监管政策中争取话语权和保障国家利益提供机会。
4.3 重视新型植物育种技术的研发和应用
我国作为人口大国和农业大国， 应抓住新兴生物技术蓬勃发展的机遇， 加快核心技术产业化进程， 实现弯道超车。一是推动植物育种工作的原始创新。继续通过高校、研究院所等常规科研主体开展新型植物育种技术的研发突破， 同时引导私人农业企业积极开展新型育种技术研究， 提高我国植物育种科技工作者的积极性， 促进国内育种产业的繁荣发展。二是鼓励私人企业育种技术的研发应用。私人农业企业是植物育种技术的应用主体， 要打造一批具有国际竞争力的农业创新企业， 需要营造更为有利的政策发展环境， 鼓励企业间优化整合资源， 激发企业新型育种技术的研发创新活力， 促进新技术尽快转化为市场生产力。
4.4 加大对新型植物育种技术工作的投入
近年来， 我国在农业育种领域积极布局各类创新主体， 优化科研创新制度环境与政策体系， 使得我国在植物育种领域取得了显著的科研成果。但新兴育种技术的快速发展提出了更高的发展要求， 使得我国在资金投入、人才配备、硬件设施等方面与发达国家相比仍然存在较大差距。为了改善这一现状， 一是要理顺育种研发投入体制， 既要加强政府财政的支持力度， 也要引导社会资金投向新型植物育种领域， 明确公共投资和私人投资在育种方面的分工， 促进育种产业的市场化发展。二是探索多元化的育种融资渠道， 完善利益分配， 鼓励种子企业与科研院所和高等院校联合开展商业化育种， 建立以企业为主体的成果转化机制， 形成以资产为导向、资本为纽带、利益共享、风险共担的产、学、研相结合的种业科技创新模式。
参考文献
[1]杨艳萍， 董瑜， 邢颖， 等。欧盟新型植物育种技术的研究及监管现状[J].生物技术通报， 2016, 32 （2） :1-6.Yang Y P, Dong Y, Xing Y, et alThe research and regulatory status of novel plant breeding techniques in Europe[J].Biotechnol.Bull., 2016, 32 （2） :1-6.
[2]Lusser M, Parisi C Plan D, et alNew plant breeding techniques.State-of-the-art and prospects for commercial development[A].In:Publications Office of the European Union.JRC scientific and technical reports[R].Luxembourg, 2012.
[3]Lusser M, Cerezo R.Comparative regulatory approaches for new plant breeding techniques[A].In:Publications Office of the European Union.JRC scientific and technical reports[R].Luxembourg, 2012.
[4]COGEM.New techniques in plant biotechnology[A].In:COGEM report CGM/061024-02[R].The Netherlands, 2006.
[5]COGEM.Zinc finger on the pulse:Developments and implications of zinc finger technology[A].In:COGEM report CGM/090616-02[R].The Netherlands, 2009.
[6]COGEM.Should EU legislation be updated?Scientific developments throw new light on the process and product approaches[A].In:COGEM report CGM/090626-03[R].The Netherlands, 2009.
[7]COGEM.Novel plant breeding techniques[R/OL].https://www.cogem.net/index.cfm/en/publications/publication/novelplant-breeding-techniques?order=relevance&q=Novel+plant+breeding+techniques&category=&from=30-09-1998&to=26-09-2018&sc=fullcontent, 2009.
[8]COGEM.The status of oligonucleotides within the context of site-directed mutagenesis[A].In:COGEM report CGM/100701-03[R].The Netherlands, 2010.
[9]ACRE.ACRE advice:New techniques used in plant breeding[R/OL].https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/239542/new-techniques-used-in-plant-breeding.pdf., 2013.
[10]Brueller W, Hartmann J, Hochesser R, et alCisgenesis---A report on the practical consequences of the application of novel techniques in plant breeding[A].In:AGES report 978-3-902611-60-4[R].2012.
[11]AGES.New plant breeding techniques.RNA-dependent DNAmethylation, reverse breeding, grafting[R].Vienna, 2013.
[12]FSANZ.New plant breeding techniques[R].Kingston, 2013.
[13]ASSAf.The regulatory implications of new breeding techniques[R/OL].http://dx.doi.org/10.17159/assaf.2016/0011.
[14]黄三文， 杜永臣， 屈冬玉， 等。同源转基因将成为利用野生资源进行作物育种的一种有效手段[J].园艺学报， 2006, 33 （6） :1397-1400.Huang S W, Du Y C, Qu D Y, et alCisgenesis will become an effective tool of crop improvement in use of wild germplasm[J].Acta Horticult.Sin., 2006, 33 （6） :1397-1400.
[15]王虹玲， 阚国仕， 李珊珊， 等。利用同源转基因技术培育氮高效利用转基因水稻[J].浙江农业学报， 2011, 23 （5） :862-869.Wang H L, Kan G S, Li S S, et alBreeding of high efficient nitrogen utilization transgenic rice through intragenesis technology[J].Acta Agric.Zhejiangensis, 2011, 23 （5） :862-869.
[16]邓兴旺， 王海洋， 唐晓艳， 等。杂交水稻育种将迎来新时代[J].中国科学：生命科学， 2013, 43 （10） :864-868.Deng X W, Wang H Y, Tang X Y, et alHybrid rice breeding welcomes a new era of molecular crop design[J].Sci.Sin.Vitae, 2013, 43 （10） :864-868.
[17]Zhang D, Wu S, An X, et alConstruction of a multi-control sterility system for a maize male-sterile line and hybrid seed production based on the ZmMs7 gene encoding a PHD-finger transcription factor[J].Plant Biotechnol.J., 2017, 16 （2） :459-471.
[18]Wang Y P, Cheng X, Shan Q W, et alSimultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J].Nat.Biotechnol., 2014, 32 （9） :947-951.
[19]Zhang H, Zhang J S, Wei P L, et alThe CRISPR/Cas9system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J].Plant Biotechnol.J., 2014, 12 （6） :797-807.
[20]姜明君， 常振仪， 卢嘉威， 等。应用TALEN技术定点突变水稻苯达松抗性基因CYP81A6[J].农业生物技术学报， 2016, 24 （8） :1225-1232.Jiang M J, Chang Z Y, Lu J W, et alTALEN-mediated mutagenesis of bentazone resistance gene CYP81A6 in rice （Oryza sativa） [J].J.Agric.Biotechnol., 2016, 24 （8） :1225-1232.
[21]Podevin N, Davies H V, Hartung F, et alSite-directed nucleases:A paradigm shift in predictable, knowledge-based plant breeding[J].Trends Biotechnol., 2013, 31 （6） :375-383.
[22]Lusser M, Parisi C, Plan D, et alDeployment of new biotechnologies in plant breeding[J].Nat.Biotechnol., 2012, 30 （3） :231-239.
[23]Holme I B, Wendt T, Holm P B.Intragenesis and cisgenesis as alternatives to transgenic crop development[J].Plant Biotechnol.J., 2013, 11 （4） :395-407.
[24]Animal and Plant Health Inspection Service （APHIS） .Pioneer Hi-Bred International, Inc.Seed production technology （SPT） process DP-32138-1 corn[R].2011.
[25]Eckerstorfer M, Miklau M, Gaugitsch H.New plant breeding techniques and risks associated with their application[R].Environment Agency Austria, 2014.
[26]EFSA Panel on Genetically Modified Organisms （GMO） .Scientific opinion addressing the safety assessment of plants developed through cisgenesis and intragenesis[J].EFSA J., 2012, 10 （2） :2561.
[27]EFSA Panel on Genetically Modified Organisms （GMO） .Scientific opinion addressing the safety assessment of plants developed using Zinc Finger Nuclease 3 and other SiteDirected Nucleases with similar function[J].EFSA J., 2012, 10 （10） :2943.
[28]BBSRC.BBSRC's position statement on new crop breeding tools[R/OL].https://bbsrc.ukri.org/documents/genetic-cropimprovement-position-statement-pdf, 2015.
[29]EPSO.EPSO statement on crop genetic improvement technologies[R/OL].http://www.epsoweb.org/file/1096, 2015-12-08.
[30]Swedish Board of Agriculture.CRISPR/Cas9 mutated Arabidopsis[Z/OL].https://www.upsc.se/documents/Information_on_interpretation_on_CRISPR_Cas9_mutated_plants_Final.pdf, 2015.
[31]Callaway E.CRISPR plants now subject to tough GM laws in European Union[J].Nature, 2018, 16:560.
[32]Heidi L.US regulation misses some GM crops[J].Nature, 2013, 500 （7463） :389-390.
[33]USDA.Secretary perdue issues USDA statement on plant breeding innovation[EB/OL].https://www.usda.gov/media/press-releases/2018/03/28/secretary-perdue-issues-usdastatement-plant-breeding-innovation, 2018-03-28.
[34]Whelan A I, Lema M A.Regulatory framework for gene editing and other new breeding techniques （NBTs） in Argentina[J].GM Crops Food, 2015, 6 （4） :253-265.