犬莱姆病间接ELISA诊断方法的建立与应用

　　
　　莱姆病（Lyme disease）是由媒介蜱传播的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferisensu lato）感染所引起的一种自然疫源性疾病，是由虫媒介蜱传播的人兽共患病，该病发生和流行的时间与蜱虫活跃时间一致。莱姆病对人类、动物的健康构成了严重的危害，主要波及野生动物及宠物的健康养殖，已成为全球严峻的公共卫生问题。1986年，自艾承绪等首次在黑龙江省海林县发现本病以来，我国目前已有30个省（市、区）经确认为莱姆病自然疫源地，主要分布在华北、西北和东北林区，分布呈现地域聚集的趋势，该病的发生依赖于其媒介蜱以及宿主动物的分布，但由于蜱虫叮咬时无痛感，且该病的早期症状不明显，常与风湿性关节炎等疾病、发烧等现象混淆导致错过最佳治疗时间。早在1993年，于美国纽约25个城镇采集的1446份犬血液样本中，犬莱姆病阳性率介于6.5％至85.2％之间。该数据表明由于人类与宠物犬关系密切，导致人感染莱姆病的机率增加。随着我国经济快速发展与人民生活水平的提高，宠物逐渐成为了人们生活中不可或缺的一部分。然而，我国对于犬莱姆病的血清学检测方法尚未报道，因此建立快速准确的犬莱姆病诊断方法迫在眉睫。本研究在国家十三五重点研发项目“宠物细菌与真菌传染病诊疗与防控新技术研究”（项目编号：2016YFD0501005）支持下，建立伯氏疏螺旋体SYBR Green I荧光定量PCR方法和犬莱姆病间接ELISA诊断方法，为宠物与人类的健康安全提供技术支持与保障。主要研究内容如下： 　　
　　I.　伯氏疏螺旋体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立本研究基于国内外主要流行的伯氏疏螺旋体菌株的3个基因型：嘎氏疏螺旋体（B. garinii）、阿氏疏螺旋体（B. afzelii）、狭义伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi sensustricto）中的16S  r RNA基因片段为模板，针对伯氏疏螺旋体的保守区域设计Real-time  PCR特异性引物，建立荧光定量方法。其中该方法标准曲线的相对系数R2为0.99，扩增效率为98.217%。特异性试验结果表明，所建立的方法只特异的检测出伯氏疏螺旋体，而与其它病原无交叉反应。敏感性试验结果表明此方法比普通PCR灵敏104倍，能够检测到的最小拷贝数为4.72  copies/μL。应用该方法对采自吉林省四平市的25只蜱虫样本进行检测，样品阳性率为40.00%。
　　
　　II.　伯氏疏螺旋体Osp C的克隆表达及抗原性分析选取伯氏疏螺旋体外膜蛋白C（Osp C），经过生物信息学分析，利用原核表达载体对B31菌株的Osp C基因进行表达、纯化和Western-blot分析，表明该蛋白具有良好的免疫原性。
　　
　　III. 犬莱姆病间接ELISA诊断方法的建立与应用本研究建立了一种用于犬莱姆病诊断和血清流行病学调查的ELISA方法。
　　
　　以Osp C蛋白为包被抗原，建立了用于犬莱姆病抗体检测的间接ELISA方法。应用该方法对所采集到的309份犬血清临床样品进行应用检测，平均抗体阳性率达20.71%。结果表明本研究所建立的ELISA方法可用于临床血清样本的检测，检测结果说明莱姆病在我国的犬群中感染率较高。
　　
　　关键词：　莱姆病，伯氏疏螺旋体，SYBR Green I荧光定量PCR，间接ELISA 。
　　 　　 　　
　　Lyme  disease  is  a  natural  epidemic  disease  caused  by  Borrelia  burgdorferi infection  transmitted  by  vector  ticks.  It  is  a  zoonosis  transmitted  by  vector  vectors. The occurrence and prevalence of Lyme disease is the same as the active time of ticks. Lyme  disease  poses  a  serious  hazard  to  the  health  of  humans  and  animals.  It  mainly affects the healthy breeding of wild animals and pets and has become a serious public health problem in the world. In 1986, since Ai Chengxu first discovered the disease in Hailin  County  of  Heilongjiang  Province,  there  are  currently  30  provinces  (cities  and districts) in China that have been identified as natural sources of Lyme disease. Lyme disease is mainly distributed in north, northwest and northeast forest regions in China. The  distribution  shows  a  tendency  of  regional  aggregation.  The  occurrence  of  the disease depends on the media and the distribution of host animals. However, because the  locust  is  not  painful  when  bitten,  and  the  early  symptoms  of  the  disease  are  not obvious,  often  confused  with  rheumatoid  arthritis  and  other  diseases,  fever,  etc., leading to missed the best treatment time. As early as 1993, the Lyme disease rate was between 6.5% and 85.2% in 1446 canine blood samples collected from 25 cities and towns  in  New  York.  This  data  shows  that  due  to  the  close  relationship  between humans  and  pet  dogs,  the  chance  of  people  being  infected  with  Lyme  disease increases. With the rapid economic development of our country and the improvement of  people’s  living  standards,  pets  have  gradually  become  an  integral  part  of  people’s lives.  However,  the  serological  detection  methods  for  canine  Lyme  disease  in  China have  not  been  reported.  Therefore,  it  is  urgent  to  establish  a  rapid  and  accurate diagnosis  method  for  Lyme  disease  in  canines.  This  research  was  supported  by  the National  Thirteenth  Five-Year  Key  Research  and  Development  Project  “Studies  on New  Technologies  for  the  Diagnosis,  Treatment,  Prevention,  and  Control  of  Pet Bacterial  and  Fungal  Infections”  (Project  Number:  2016YFD0501005).  The establishment  of  SYBR  Green  I  fluorescence  quantitative  PCR  method  and  canine Lyme  disease  indirect  ELISA  diagnosis  method  provide  technical  support  and protection  for  pets  and  human  health  and  safety.  The  main  research  content  is  as follows:
　　
　　I.Establishment of SYBR Green I Real-time PCR Assay for Detection of Borrelia burgdorferi This  study  was  based  on  the  three  genotypes  of  the  predominant  strains  ofBorrelia  burgdorferi  at  home  and  abroad:  the  16S  r RNA  gene  fragment  in  Borrelia garinii,  Borrelia  afzelii,  Borrelia  burgdorferi  sensu  stricto  as  a  template,  which  is conserved  against  Borrelia  burgdorferi.  Regional  design  of  Real-time  PCR  specific primers,  established  SYBR  Green  I  fluorescence  quantification  method.  The  relative coefficient  R2  of  the  fluorescence  quantitative  standard  curve  is  0.99,  and  the amplification  efficiency  is  98.217%.  The  specific  test  results  showed  that  the established  method  only  detected  B.  burgdorferi  specifically,  but  did  not  cross-react with other pathogens. Sensitivity test results show that this method is 104 times more sensitive  than  ordinary  PCR,  and  the  minimum  copy  number  that  can  be  detected  is 4.72 copies/μL. This method was applied to the detection of 25 tick samples collected from Siping City, Jilin Province. The positive rate of samples was 40.00%.
　　
　　II.Cloning  and  expression  of  Osp C  from  Borrelia  burgdorferi  and  antigenicity analysis Osp C  of  Borrelia  burgdorferi  was  selected.  After  bioinformatics  analysis,  the Osp C  gene  of  B31  strain  was  expressed,  purified  and  Western-blot  analyzed  using prokaryotic expression vector, indicating that the protein had good immunogenicity.
　　
　　III.Establishment and application of indirect ELISA for diagnosis of canine Lyme disease This  study  established  an  ELISA  method  for  diagnosis  of  canine  Lyme  disease and  serum  prevalence  investigations.  Osp C  protein  was  used  as  coating  antigen  to  establish an indirect ELISA for detection of Lyme disease in canines.This method was applied  to  the  clinical  samples  of  309  canine  serum  samples  collected.  The  average antibody  positive  rate  was  20.71%.  The  results  show  that  the  ELISA  method established in this study can be used for the detection of clinical serum samples. The test  results  show  that  the  infection  rate  of  Lyme  disease  is  high  in  the  canine population in China.
　　
　　Key words:  Lyme disease, Borrelia burgdorferi, Real-time PCR, Indirect ELISA 。
　　 　　
　　莱姆病(Lyme  disease，LD)，是由螺旋体家族中的伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi  sensu  lato）经感染的蜱叮咬传播给人和动物。1975年，一系列由媒介蜱传播而引起的“少年红斑性关节炎”在美国的康乃狄克州莱姆镇引起了人们的重视[1]。7年后，由Willy  Burgdorferi首次在肩突硬蜱（Ixodes  scapularis）中分离到莱姆病的病原体伯氏疏螺旋体[2]。随后，人们在莱姆病患者的关节滑液、脑脊液、血液、皮肤等组织也分离到伯氏疏螺旋体[3]。在中国，首次出现莱姆病的报道是在1986年，艾承绪在黑龙江省海林县林区发现了莱姆病，并成功分离到伯氏疏螺旋体[4]。目前，已有30个地区都有过莱姆病的相关报道，这一现象表明莱姆病在我国的分布十分广泛[5,6,7]。莱姆病在全世界范围内流行较为广泛，在美国尤为严重，又有“第二艾滋病”之称，是一种全球性、对人类健康造成危害的一类虫媒传染病。该病已经成为我国相当重要的人兽共患病，应当给予高度重视。
　　
　　目前，人与人之间、动物与人之间传播莱姆病报道较为罕见。莱姆病主要传播途径为蜱虫叮咬，因此莱姆病的流行与蜱虫的活动期息息相关，一年中的4至8月，尤其是5至6月初，是蜱虫最为活跃的时间，因此预防莱姆病主要可以从预防蜱虫叮咬做起。
　　
　　1、伯氏疏螺旋体病原学。
　　
　　伯氏疏螺旋体是革兰氏阴性菌，属于原核生物界、螺旋体目、螺旋体科、疏螺旋体属[8]。单细胞疏松盘绕的左旋螺旋状细菌运动方式主要以旋转、扭曲和抖动为主，其细胞结构由原生质、鞭毛、外膜和表层组成。伯氏疏螺旋体长为10-20μm左右，宽0.18-0.25μm左右，通常有大而宽疏的螺旋4-20个，鞭毛位于外膜和胞浆膜之间，称为轴鞭毛，伯氏疏螺旋体的特别之处是不含有脂多糖。伯氏疏螺旋体可以在BSK-H液体培养基中30-34℃中培养[9]。目前，伯氏疏螺旋体分为以下22种基因型：
　　
　　B. burgdorferi s.s、B. afzelii、B. garinii、B. lusitaniae、B.valaisiana、B. bissettii、B. andersonii、B. americana、B. tanukii、B. turdi、B. sinica、B.  chilensis、B.  californiensis、B.  japonica、B.  carolinensis、B.  finlandensis、B. bavariensis、B.  kurtenbachii、B.  yangtze、B.  spielmanii、B.  chilensis、B.hermsii[10,11,12]。其中已经报道具有致病性的有 8种，分别为：B. burgdorferi s.s、B.  afzelii、B.  garinii、B.  lusitaniae、B.  valaisiana、B.  bissettii、B.  americana、B.andersonii[13]。B. burgdorferi s.s主要在欧洲和北美洲流行，B. afzelii、B. garinii、B.  valaisiana和B.  lusitaniae主要在欧亚大陆之间流行，B.  turdi、B.  tanukii、B.japonica这三种主要在日本分布，B.  andersonii和B.  bissettii主要分布于北美洲[14,15]。我国主要分布的伯氏疏螺旋体有以下6种基因型：B.  burgdorferi  s.s　、B.garinii、B. afzelii、B. valaisiana、B. sinic和B. yangtze，其中最主要的为B. afzelii和B. garinii两种基因型，B. afzelii主要分布于我国的南方和北方，B. burgdorferis.s、B. garinii则主要分布于我国的北方[16,17,18]。
　　
　　2、伯氏疏螺旋体生活史。
　　
　　伯氏疏螺旋体主要在宿主动物和蜱虫中繁殖并传播。伯氏疏螺旋体的感染谱很广，主要包括脊椎动物，其中啮齿类有：鼠类、兔子；大型的家畜和野生动物有：马、牛、羊、犬、鹿等[19]。伯氏疏螺旋体在蜱虫中不经卵垂直传播，幼蜱在吸食被伯氏疏螺旋体感染了的宿主动物血液时，伯氏疏螺旋体随着血液进入中肠，病原在中肠定居，直到幼蜱蜕皮完成；若蜱在吸食动物血液后，伯氏疏螺旋体会在若蜱中肠快速增值，随后迅速的迁移至唾液腺。当蜱虫再次叮咬宿主动物时，伯氏疏螺旋体会随着唾液腺进入宿主体内，从而引发宿主感染[20,21]。研究表明，莱姆病病原在感染哺乳动物时，病原体会在叮咬部位停留12-48h，随后在分散到不同的组织器官中[22]。
　　
　　3、莱姆病流行病学。
　　
　　莱姆病在全世界范围内流行较为广泛，目前在除北极以外的其它大陆均有流行报道，且发病区域逐渐扩大，发病率呈现出上升趋势。研究发现该病成区域性流行，主要流行区域与硬蜱的生活范围息息相关。美洲莱姆病疫源地主要分布在中西部及东北地区；欧洲主要分布于北欧及中欧地区[23,24]；亚洲主要分布于中国和日本。目前我国30个省市自治区均有报道，其中有19个地区为莱姆病自然疫源地[25]。莱姆病在我国主要分布于东北、华北和西北部的林区地带[26]。莱姆病的发病与蜱虫的活动息息相关，具有季节性发病规律。初发与4月底，6月中上旬达到发病高峰，8月后会有个别相关性病例。不同人群的感染率有所不同，特别是林区工作人员，以及去林区旅游人员的感染率较高，这也跟媒介蜱的活动范围有关[27,28]。
　　
　　伯氏疏螺旋体的传播媒介主要为蜱，全世界发现的蜱种已经超过800种，目前我国发现的蜱种有100多种[29]，其中有26种可感染或携带伯氏疏螺旋体[30]。北美洲地区莱姆病的主要传播蜱种为太平洋硬蜱（I.pacificus）和肩突硬蜱（Ixodesscapularis）。欧洲地区则主要为全沟硬蜱（I. persulcatus）和篦子硬蜱（I.ricinus）[31,32]，中国北方地区莱姆病传播的蜱种为全沟硬蜱（I. persulcatus），南方地区则为二棘血蜱（Haemaphysalis bispinosa）、粒形硬蜱（I. granulatus）和长角血蜱（H.longicornis）[33]。我国研究人员在新疆地区采集到的亚洲璃眼蜱（Hyalommaasiaticum）、图兰扇头蜱（Rhipicephalus  turanicus）、草原革蜱（Dermancentornuttalli）、边缘革蜱（D. marginatus）和刻点血蜱（H. punctata）也已分离到伯氏疏螺旋体[34,35]。
　　
　　4、伯氏疏螺旋体感染与致病机制相关蛋白。
　　
　　莱姆病的生活史主要在媒介蜱跟宿主动物中，为了适应从媒介动物到宿主动物的不同环境，在传播感染过程中，伯氏疏螺旋体通过基因的差异表达的调控机制用来逃避宿主免疫。蜱在叮咬宿主动物吸食血液的过程中，伯氏疏螺旋体下调表达的基因有Osp A、P22和P66，最主要有Osp C、Osp E、Osp F、Dbp A和Mlp8[36]。
　　
　　感染了伯氏疏螺旋体的蜱一旦吸食了血液，螺旋体会从中肠转移到唾液腺，这期间Osp A表达量下调，同时Osp C表达量上调。当伯氏疏螺旋体从蜱中肠迁移到唾液腺时，Osp C基因表达量上调。当伯氏疏螺旋体进入蜱体内时，螺旋体上调表达的Osp A和Osp B蛋白能够与蜱体内的TPOSPA结合，有利于维持螺旋体在蜱体内繁殖生存。唾液腺中的唾液蛋白Salp15与Osp C结合，从而保护伯氏疏螺旋体逃避天然免疫[37,38,39]。蜱在吸食血液时，BB0323基因会上调表达，该蛋白对病原体在蜱体内的维持也非常重要[40]。Vls E基因能够编码不同的Vls E蛋白，这可以保护螺旋体在不同的环境改变抗原，从而保护伯氏疏螺旋体逃避宿主免疫，对其在哺乳动物体内的感染及繁殖至关重要[41]。
　　
　　5、莱姆病临床症状及病理变化。
　　
　　莱姆病是一种慢性传染病，可以入侵人体多个器官组织，从而引起器官损伤。根据病程的发展，莱姆病可以分为3个时期，早期：局部性感染；中期：播散性感染；晚期：持续性感染[42]。
　　
　　1、人感染莱姆病的主要症状游走性红斑（ECM）是本病最典型的病症之一。蜱叮咬后，伯氏疏螺旋体随唾液腺进入易感动物或人体内，几天内叮咬部位会出现红色的斑疹，随后逐渐扩大，潜伏期通常为1-3周（典型的为7-10天）。该症状可出现于身体的任何部位，常见于大腿、腋下、腹股沟、耳部。中期播散型感染主要表现为神经系统的损伤，以颅神经损伤、面瘫、脑膜炎和神经炎等症状。晚期持续性感染表现为关节炎，通常为关节肿胀和疼痛，其中膝关节症状尤为严重。研究表明，不同的基因型伯氏疏螺旋体会呈现出不同的致病性，且呈现不同的组织嗜性，B. afzelii主要表现为慢性皮炎[43]。B.  garinii常表现为淋巴细胞脑膜炎，颅神经炎等，主要与神经性的莱姆病相关[44]，B. burgdorferi s.s的临床症状主要表现为关节炎[45]。上述三种基因型均可表现为游走性红斑的临床症状。2、犬感染莱姆病的主要症状主要是由关节炎引起的跛行，厌食，发烧，嗜睡，淋巴结肿大以及肾小球肾炎[46,47]。
　　
　　6、莱姆病的诊断方法。
　　
　　随着人们对莱姆病的深入研究，已经建立了一系列的有关莱姆病的诊断检测方法。主要有：病原学检测、核酸检测及血清学检测。
　　
　　1、病原学检测。
　　
　　病原的直接检测主要通过选取被感染的皮肤组织直接涂片染色后在光学显微镜下观察，该方法对工作人员要求较高且需要有丰富的专业知识，同时该方法相较于其它检测方法检出率较低，因此临床上较少应用病原直接检测的方法。伯氏疏螺旋体通常用BSK-H液体培养基进行体外培养。将感染的组织研磨过滤接种于含有6%兔血清的BSK-H液体培养基中，放置于33℃的恒温培养箱进行培养，每隔1天取样暗视野显微镜下观察，一般7-10天便可观察到伯氏疏螺旋体[48]。实验室通常将病原分离作为“金标准”，然而由于伯氏疏螺旋体生长较为缓慢，生长条件较为严格，培养基易污染等原因，所以病原的分离培养不常用于临床诊断。
　　
　　2、血清学检测。
　　
　　血清学检测是目前临床上最常用的检测方法，现在用于莱姆病的血清学检测方法有：间接免疫荧光（IFA）、免疫蛋白印迹试验(Western blot)和酶联免疫吸附试验（ELISA）。IFA是最早用于该病的血清学诊断方法，其操作简单易懂，但是容易出现假阳性。Western  blot检测方法常用于检测伯氏疏螺旋体的特异性蛋白组份抗体，虽然有良好的特异性，然而由于实验条件的限制，临床上很难大量使用[50,51,52]。目前在临床诊断，特别是进行大规模的血清学流行病学调查时，ELISA就显示出了操作方便，灵敏度高的优势。目前针对于犬莱姆病的ELISA检测方法国内尚未报道，这就急需科研人员开发出犬莱姆病的ELISA检测诊断方法。
　　
　　3、分子生物学检测。
　　
　　随着分子生物学近几年的飞速发展，基于核酸的分子生物学检测方法也同样用于莱姆病的临床诊断。聚合酶链式反应（PCR）技术已经作为一种常用的检测莱姆病的诊断技术。该方法常用的检测靶基因主要包括16S r RNA、5S-23S r RNA、Fla A、Fla B等基因。在传统的PCR技术上人们又建立了环介导等温扩增技术（LAMP）和反向线性杂交（RLB）技术，从而更方便更准确的提供伯氏疏螺旋体的检测结果[53,54]。
　　
　　7、本研究的目的意义。
　　
　　莱姆病在全球的分布较为广泛，是一种重要的由媒介蜱传播的人兽共患病。该病在我国分布广泛，伯氏疏螺旋体的宿主动物种类繁多，给我国人民及宠物健康带来严重危害。目前国内外针对莱姆病分子生物学检测方法主要是PCR检测方法，该方法较为快速，但是相对于荧光定量PCR检测方法灵敏度较低。目前已经报道的有关莱姆病的荧光定量PCR检测方法是探针法，其中探针价格昂贵且只能用于该段基因伯氏疏螺旋体的检测，成本较染料法的高，为了能够更广泛的用于临床诊断，本研究通过参考Gene Bank中已经发表的伯氏疏螺旋体的16Sr RNA为靶标序列设计引物，建立了伯氏疏螺旋体的SYBR  Green荧光定量检测方法，对该方法进行了特异性和敏感性的评价，并对我国吉林省四平市采集的蜱样本进行检测。
　　
　　宠物犬与人们生活的关系越来越密切，目前IDEXX公司的SNAP 4DX检测试纸已经在国内外运用多年，然而胶体金试纸条常常出现假阳性等问题。且该试纸条是基于VIs E蛋白所建立的检查方法，A Rogovskyy于2012年研究结果表明VIs E蛋白存在抗原表位变异，因此该检查方法存在漏检、错检的可能。为了有效提高宠物细菌性传染病的诊断与鉴别工作效率，本研究选用Osp C蛋白，该蛋白在蜱虫叮咬犬支后，早期在犬体内大量表达，因此可极大提升所建方法的灵敏度。本研究利用原核表达系统，大量表达并进行纯化Osp C蛋白，建立了相应的犬莱姆病的间接ELISA检测方法。对该方法的特异性和敏感性进行了评估，发现本研究建立的间接ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性，并对我国部分地区采集的犬血清进行了流行病学的调查。
　　
　　本研究主要分为以下几部分，第一部分是基于16S r RNA基因片段，建立伯氏疏螺旋体的SYBR Green荧光定量检测方法及初步验证。第二部分对伯氏疏螺旋体的Osp C蛋白进行原核表达及免疫原性鉴定。第三部分是犬莱姆病的间接ELISA检测方法的建立及应用。
　　 　　
　　第二篇 研究内容
　　
　　第1章 伯氏疏螺旋体SYBRGreenI荧光定量PCR方法的建立及验证
　　
　　1.1、 材料.
　　1.2、 方法.
　　1.3、结 果.
　　1.4、讨论.
　　1.5、 小结.
　　
　　第2章  伯氏疏螺旋体OspC的克隆表达及抗原性分析
　　
　　2.1、材料
　　2.2、方法.
　　2.2.1、蛋白的可溶性分析
　　2.3、结果
　　2.4、讨论 .
　　2.5、小结.
　　
　　第3章  犬莱姆病间接ELISA诊断方法的建立及应用
　　
　　3.1、材料.
　　3.2、方法 .
　　3.3、结果
　　3.4、讨论.
　　3.5、小结.

　　结  论

　　1.　建立了伯氏疏螺旋体SYBR  Green  I荧光定量PCR方法，该方法的敏感性为常规PCR检测方法的104倍。且与钩端螺旋体、大肠杆菌、埃里希氏体和绿脓杆菌阳性样品检测结果均为阴性，说明该方法具有较高的特异性和敏感性，适用于伯氏疏螺旋体的检测。

　　2.　利用原核表达系统表达伯氏疏螺旋体Osp C蛋白，并进行Western-blot实验验证，结果表明该蛋白具有良好的免疫原性，并与本研究中所用到的其它病原犬阳性血清无交叉反应。应用Osp C蛋白建立了间接ELISA方法，当阳性阈值为16.02%，其特异性为96.00%（95%  CI  =86.3-99.5），敏感性为95.35%，适用于犬莱姆病抗体检测。

　　3.　应用建立的犬莱姆病间接ELISA方法，对来自北京、上海、江西、辽宁和吉林五个地区的309份犬血清样品进行了犬莱姆病的抗体检测，阳性率为20.71%，表明我国部分地区犬莱姆病的感染率较高。莱姆病作为一种人兽共患病，宠物犬莱姆病的及时诊断与防治对于兽医公共卫生具有重要意义。

　　参考文献