中文摘要
本试验旨在建立六价铬(Cr(VI))在中华田园犬心脏的中毒模型，试验记录并检测35d以内的心电图和3d内的心肌酶参数，病理组织学，炎性因子，氧化应激酶和ATP酶等指标的变化。为中华田园犬心脏组织的重金属中毒机理的研究提供可靠的数据基础。
本试验以重铬酸钾(K2Cr2O7)作为Cr(VI)的铬源，对成年中华田园犬进行重铬酸钾(K2Cr2O7)攻毒，从而对其心脏组织的毒理作用进行研究；试验分为对照组和低(L)、中(M)、高(H)剂量试验组，对照组不添加重铬酸钾，试验组的添加剂量由低到高分别为0.92mg/kg，1.15mg/kg，1.38mg/kg。通过使用三通道心电图机标准肢导联，记录中华田园犬在俯卧位状态下的相对静态心电图。攻毒前和攻毒后的72h内采用前肢皮下绕静脉采取血液，离心取上清检测心肌酶。35d后将中华田园犬进行安乐死，采取心脏组织进行病理组织学分析。利用匀浆机将心脏组织研磨，离心提取上清检测心脏组织内炎性因子。检测氧化应激酶，腺苷三磷酸酶(ATPase)的参数。试验结果表明，35d试验组的心电图H组、M组和L组都表现出了I、II和III导联明显的ST段的上升，T波增高。a VF导联H组表现出T波增高。导联a VRL组、M量组和H量组T波和对照组相比出现高尖；心肌酶谱中，四种心肌酶谷草转氨酶(AST)，磷酸肌酸激酶(CK)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)在攻毒后均发生显着变化(P<0.05)，试验组中M组和H组的心肌酶含量随时间的变化明显上升(P<0.05)；病理切片显示仅H组有轻微病变，心肌细胞结构基本正常，细胞浆轻微疏松，排列比较整齐；氧化应激指标结果显示，过氧化氢酶(CAT)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)值随Cr(VI)剂量的增加而下降，丙二醛(MDA)含量随Cr(VI)剂量的增加而增加；炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)都有不同程度的升高，而IL-10含量却随着Cr(VI)剂量的增加而下降 ；腺苷三磷酸酶(ATPase)的含量也随着Cr(VI)剂量的增加而下降。
结论：本试验成功建立六价铬中华田园犬心脏组织中毒模型，检测了试验犬心电图、心肌酶参数、病理组织学、炎性因子、氧化应激酶和ATPase等指标的变化。其结果表明不同浓度的Cr(VI)对中环田园犬的心脏造成不同程度的损伤，并且Cr(VI)进入中华田园犬机体内可引起心脏的氧化损伤，炎症反应和ATPase含量的改变。
关键词： 中华田园犬；Cr(VI)；心电图；ATPase；炎性因子。
Abstract
This experiment aims to establish a poisoning model of hexavalent chromium (Cr(VI)) in heart of Chinese rural dog. The test records and detects the electrocardiogram within 35d and the myocardial enzyme parameters within 3d. Histopathology, inflammatory factors, oxidation should be changes in indicators such as kinases and ATPase. It provides a reliable data foundation for the study of the mechanism of heavy metal poisoning in Chinese rural dog heart tissue.
In this experiment, potassium dichromate (K2Cr2O7) was used as the chromium source of Cr(VI), and the adult Chinese dog was challenged with potassium dichromate (K2Cr2O7) tostudy the toxicological effects of its heart tissue. In the control group and the low (L), medium (M), and high (H) dose test groups, the control group did not add potassium dichromate. The additive amount of the test group was 0.92 mg/kg, 1.15 mg/kg and 1.38mg/kg. The relative static electrocardiogram of the Chinese rural dog in the prone position was recorded by using a three-channel electrocardiograph standard limb lead. Before the challenge and within 72h after the challenge, the blood was taken from the forearm subcutaneous vein, and the supernatant was centrifuged to detect the myocardial enzyme. The Chinese rural dog was euthanized 35d later, and histological analysis was performed using cardiac tissue. The heart tissue was ground using a homogenizer, and the supernatant was centrifuged to detect inflammatory factors in the heart tissue. The parameters of oxidative kinase, adenosine triphosphatase (ATPase) were measured. The results of the test showed that the electrocardiograms of group H, group M and group L of the 35d test group showed significant ST segment elevation and increased T wave in leads of I, II and III. The H group of the a VF lead showed an increase in T wave. The lead waves of the a VRL group, the M group, and the H group were higher than those of the control group. In the myocardial enzyme spectrum,four myocardial enzymes, aspartate aminotransferase (AST), phosphocreatine kinase (CK),and phosphocreatine kinase were co-workers. Enzyme (CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH) showed significant changes after challenge (P<0.05). The myocardial enzyme content of M group and H group increased significantly with time in the experimental group (P<0.05).Pathological sections showed only mild lesions in group H, myocardial cell structure was basically normal, cytoplasm was slightly loose, and the arrangement was relatively neat.Oxidative stress index showed that catalase (CAT) and total superoxide dismutase (T-SOD)decreased with increasing Cr(VI) dose, and malondialdehyde (MDA) content increased withincreasing Cr(VI) dose. Inflammatory factor interleukin-1β (IL-1β), interleukin Both -8 (IL-8)and tumor necrosis factor-α (TNF-α) increased to varying degrees, while IL-10 content decreased with increasing dose of Cr(VI). Adenosine triphosphatase ( The content of ATPase) also decreased with increasing Cr(VI) dose.
Conclusion: This experiment successfully established a hexavalent chromium Chinese rural dog heart tissue poisoning model, and tested the changes of electrocardiogram,myocardial enzyme parameters, histopathology, inflammatory factors, oxidative kinase and ATPase. The results showed that different concentrations of Cr(VI) caused different degrees of damage to the heart of the Chinese rural dog, and Cr(VI) could cause oxidative damage,inflammation and ATPase content in the Chinese rural dog.
Key words: Chinese rural dog; Cr(VI); ECG; ATPase; Inflammatory factor。
1、引言。
1.1、中华田园犬的介绍。
中华田园犬(拉丁学名：Canis lupus familiaris)，传统称呼为“土狗”，北方有的地方又叫“柴狗”，属于食肉目、犬科、犬亚科的一种哺乳动物，长大后肩高约25-55厘米，体重约10-30公斤。中华田园犬与中国狼、草原狼外形非常相似，嘴短，额平。中国土狗主要分布于长城以南、青藏高原以东，以中部地区为中心的低海拔的汉族集聚区域，广泛存在于中国汉族农村及东南亚地区，现在城市化发展飞快，人们广泛把中华田园犬当作宠物狗饲养。中华田园犬是中国汉族几千年农耕社会背景下的产物，被称为“中华国犬”(李扬，2018 )。
1.1.0、中华田园犬的历史。
秦始皇一统中原时有个历史典故：秦朝丞相李斯临刑悲伤的说：“吾欲与若复牵黄犬俱出，上蔡，东门逐狡兔，岂可得乎”。这里的“黄”指的就是这种用于行猎的田园犬。在现代汉族民间人们称之为“土狗”，顾名思义就是本土本地区的狗；北方有的地方又叫“柴狗”，因为北方气候寒冷，狗一般都会窝在柴灶或柴堆旁；东方江浙沪地区则一般被称为“草狗”，这里的“草”就是“土”、本地产的意思。当地的农民家中都会养一两条这样的狗看家作伴。土狗的定义是指某地域的特产犬种，适合当地的气候特点，比其他种类犬更容易独立生存。
中国土狗大多生存于中国农村、郊外，多为放养型且在原生犬种中占多数比例。部分学者认为中华田园犬与日本柴犬在遗传上的确存在联系，很可能是由同一犬类祖先进化而来的。但由于地理环境和气候等原因所以产生不同的性状特征。现今绝大部分犬类的历史发源地都被证明是中国或者说的古代的中国。由中科院院士张亚平带领的研究小组完成的论文《走出东亚南部：全世界家犬的起源历史》中研究称：包括吉娃娃、松狮等在内的全世界的家犬，都起源于中国南方等东亚南部地区，自灰狼进化而来(丁昭莉.2009)。东亚南部地区的家犬的基因组拥有全世界最丰富的遗传多样性。
1.1.1、形态特征。
不同地区之间的中国土狗有大小、形态的差异，但它们之间都有一定共同的特点。有些地方之间的差异比较大，这是由于自由繁殖遗传的不稳定性，所以不同地方的土狗就产生许多各自的特色。下面总结出的是部分土狗的外貌特征：
头部：头部特征更加接近于其祖先灰狼的外貌，嘴尖，嘴短，额平。
耳朵：耳位高，耳小且直立或半直立，半直立的耳朵下垂方向是向犬的头部正前方半下垂。(不同于其它一些犬种耳朵大且耳朵向头部两边全塌下去)尾巴：尾巴向上翘起，特别在行走时会高高翘起，以金钱尾和镰刀尾为主。
后腿：当站立静止时，后腿明显很平直并垂直于地面，踝关节弯曲不明显。
毛：棕毛为主，毛质粗，容易保持干净。颜色黄、白、黑、杂色都有。
体形：身体匀称而紧凑；中等大小，身长与肩高比约成1:1，加上后腿平直并几乎垂直于地面使整个身体成正方形。
柴犬近亲：中型犬，跟柴犬相似，黄色外体，白色脸部，耳朵竖起，适合纯种狗配种生育后代。
1.1.2、生活习性。
中华田园犬性格温顺，比较容易饲养，忠诚度特别高；适应群居生活，地域性比较强，几乎不生皮肤病。在大部分农村地区被用于看家以及早期的狩猎帮手。
1.1.3、取食习性。
中华田园犬是肉食动物，因此在喂养时，在狗料配制中要有较多的动物蛋白(肉食)，辅助以少量的素食，这样才能保证中华田园犬生长发育和机体所需的营养健康。中华田园犬有的时候也会吃少量的草，偶尔也吐掉，吃草并不是因为缺少食物，而是为了清胃。
犬类的肠胃结构比较独特。犬类的胃相对比较大，约占腹腔体积的2/3，但是肠结构却相对小，约占腹腔体积的1/3，所以犬类基本上是利用胃部来消化和吸收，容易消化动物类蛋白，不易消化像植物的茎，叶等植物性蛋白。
中国田园犬也与其他犬类一样有食粪的习性，就是以人类和自身的粪便为食物的习性。研究表明，在近万年的驯化进程中犬类与人类的相处而养成的一种习性，这是古代食物匮乏时期犬类被动接受粪便作为食物的原因之一。另有一些人认为这是狗在食物缺乏、营养不良或者患某种慢性病期间的一种病态表现。
1.1.4、行为习性。
等级制度：中华田园犬在群居时，有一定等级制度。建立这样的等级制度可以保持整个群体的稳定，减少由食物分配、生存空间和异性选择而引起的“战争”。
睡前转圈：卧下前，中华田园犬总在周围转一转，确定没有危险之后，才放心入眠。
喜欢被抚摸：中华田园犬的肚皮、背部和脖颈部喜欢被轻轻地抚摸。
对陌生人的态度：中华田园犬的行为准则是根据视线的高度来判断对手的是否充满危险和敌意。
露肚皮：中华田园犬让人家看它的肚皮是向对方表示顺从、认错和撒娇。犬类从不攻击倒下露出肚皮的其他犬类。
摇尾巴：中华田园犬的摇尾巴是一种沟通的形式。
避开群体：如果中华田园犬生病时，会刻意地避开主人或者其他的同类，躲在阴暗处去康复或死亡。
撒尿标记：中华田园犬利用尿液标记“领地、吸引异性、或做路标”。从狼演化的犬类也遗传着祖先这种习性。
领地意识：中华田园犬具有领地习性，占有并加以保护自己的领地，禁止其他动物侵入。它们利用具有特殊气味的粪便、汗液和在地上抓画等方法，以此为记号来标记领地。
1.1.5、分布范围。
1.1.5.1、总体分布。
中国田园犬主要分布于长城以南，青藏高原以东，以中原为中心的广大地域(董淑慧.2017)，在这个区域里环境温暖，比较适宜生存繁衍，这样的地域分布清楚地明确了中华田园犬的生存环境是低海拔农耕社会地区。当然随着中华民族几千年来的不断迁徙，使中华田园犬的分布范围也在不断扩大。比如中国东北，由于汉族的分布扩散，那里农村也有很多不同于东北牧区的中华田园犬，也有一部分与其它地区的狗种杂交形成了新的犬品种。但可以肯定中华田园犬是中国中原地区农耕社会的产物。
1.1.5.2、亚种分布。
中华田园犬广泛分布于中国汉族农村，由于地域、环境和血缘等关系的因素形成了很多不同的品系、亚种。从犬的外型特点和分布区域进行分析，中国土狗大致可分为三大品系，分别是北方品系、江浙品系、两广品系。注：三大品系是从宏观上分析得出的结果，在很多小的地方肯定还有一些独特的亚中华田园犬种出现。在这三大品系分布区之间还存在很大一部分品系的边渡地带，这里的狗也呈过渡品种出现。三大品系的分布地带呈一个三角形，中间有一块较大的空白区域以湖北湖南为主，这一地区的中华田园犬是否是独立品系还是过渡品种有待进一步的研究论证。
1.1.6、繁殖方式。
中国土狗全年可以繁殖，高峰期为雨季的后半期，即每年的3月到6月间和9月到11月间繁殖。孕期约为60d左右，每胎产通常为4仔左右。生殖间歇期为6-8月，断奶期为10周左右。一般40d后，小狗就会开始外出活动，6-8个月达到性成熟。
1.2、铬的介绍。
近些年来，随着我国的重工业不断发展，工业污染尤其重金属污染愈发严重，给自然环境和居民生活造成了极大的危害。铬盐是重要的无机化合物之一，广泛应用于电镀、印染、皮革等行业生产制造中得到大力的应用(Cervantes, 2001)，但铬及其化合物的排放也对环境造成重金属的污染。目前有关铬排放物所造成的重金属污染的报道已经越来越多，比如长期接触铬化合物的工人内脏组织器官或皮肤发生癌症和损伤(Quievryn et al.,2006)。虽然铬常见化合价为正二价、正三价和正六价，但是自然环境中只有三价铬(Cr(Ⅲ))和六价铬(Cr(VI))形态具有稳定性。Cr(Ⅲ)毒性较低，很难进入细胞内(井明艳，2005)。Cr(VI)作为一种强氧化剂，很容易进入细胞内部破坏细胞的结构，致使机体造成损伤。许多的研究表明，Cr(VI)对生物的机体具有致畸变、致突变作用(Svecevi?, 2006; Xieet al., 2005;陈琼宇，2000)。因此Cr(VI)被认为是一种具有很强毒力的致癌物质。
1.2.1、铬的理化特性。
铬是一种银白色且硬脆性金属，纯铬有延展性。固态密度为7.20g/cm3，液态密度为6.9g/cm3，熔点是1857±20℃，沸点是2672℃。铬可溶于强碱溶液，具有很高的耐腐蚀性，在空气中氧化很慢。化学元素周期表中属第一过渡系的VIB族，原子序数是24，元素原子质量59.996。在自然界中，铬从零价到正六价呈现多种价态，但Cr(III)和Cr(VI)的结构比较稳定，因此一般都是以Cr(III)和Cr(VI)形式存在。在自然界中铬元素在土壤、大气、水和动植物体内广泛的分布。地壳中铬的含量大约在200mgkg-1左右，约占地壳总量的0.02%。在铬的多种价态中，铬的氧化性强弱与铬价态有很大的关系，其中二价铬在空气中极不稳定，会氧化形成Cr(VI)从而形成铬酸盐和重铬酸盐(OnderciMet al., 2003)(刘显军等，2004)。在无机铬中常见的形态为正三价和正六价,而Cr(VI)的毒性比Cr(Ⅲ)大100-1000倍(李艳廷等，2000),因此Cr(VI)化合物是铬毒性研究的主要对象。
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1.2.2、 在机体内的铬.
1.2.2.1 、机体内铬的吸收
1.2.2.2 、机体内铬的代谢
1.2.2.3、铬的生物学机制
1.2.2.4 、铬对脏器的作用
1.2.2.4.1 、铬对肝脏的作用
1.2.2.4.2 、铬对肾脏的作用
1.2.2.4.3 、铬对肺脏的作用
1.2.2.4.4、铬对机体抗氧化能力的影响
1.3、对本试验检测指标的介绍
1.3.1、 心电图
1.3.2、心肌酶
1.3.3、 抗氧化指标
1.3.4 、炎性指标
1.3.5 、ATPase
1.4、研究目的和意义
2、材料与方法
2.1、试剂和仪器
2.1.1 、试剂.
2.1.2、仪器
2.2、试验分组
2.3、心电图检测
2.4、心肌酶检测.
2.5、心脏组织病理切片的制作.
2.6、组织匀浆的制备.
2.7、氧化应激的检测
2.7.1、心脏组织蛋白含量的测定.
2.7.2、心脏组织过氧化氢酶(CAT)的测定.
2.7.3、心脏组织丙二醛(MDA)的测定
2.7.4、心脏组织超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的测定.
2.8、心脏组织的炎性因子
2.9 、ATPase的检测
2.10、统计分析
3、结果
3.1、 一般观察
3.2、心电图指标
3.3、心肌酶
3.4、病理组学观察
3.5、氧化应激.
3.6、炎性因子
3.7 、ATPase的活性
4、讨论
4.1、 心电图
4.2、心肌酶
4.3、病理切片
4.4、氧化应激
4.5、 炎性因子
4.6、 ATPase
5 结论
本试验成功建立Cr(VI)在中华田园犬的心脏组织的中毒模型，研究了重金属中毒模型建成后35d内心电图异常变化和3d内心肌酶变化，以及心脏组织病理组织学观察，氧化应激酶，炎性因子和ATP酶的变化，其中心电图的ST段和T波，CK-MB，AST，CK，LDH，CAT，T-AOC，MDA，IL-1β，IL-8，TNF-α，IL-10，Na+-K+-ATPase，和Ca2+-Mg2+-ATPase试验组与对照组有显着性差异。不同剂量的Cr(VI)对中华田园犬心脏造成不同程度的损伤，并且Cr(VI)进入中华田园犬体内可引起心脏的氧化损伤和ATPase含量的改变。初步确立了Cr(VI)对中华田园犬心脏毒理作用的相关指标变化，为研究中华田园犬重金属中毒提供一定的理论基础。
参考文献
