摘 要
为了解吉林省牛病毒性腹泻（BVD）、牛传染性鼻气管炎（IBR）和牛呼吸道合胞体病（BRS）3 种病毒性传染病的流行情况，本研究应用商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）方法和实时定量 PCR（RT-PCR）方法对采集自吉林省内 9 个地区的 11 个县（市）区内没有免疫的牛场（包括肉牛场、奶牛场、屠宰场、散养户）的 2200 份血清进行检测，其中每个县（市）区 200 份血清样本。
应用 ELISA 试剂盒检测不同牛场中 BVD、IBR、BRS 抗体阳性率情况，结果显示：
肉牛场、奶牛场、屠宰场、散养户中 IBR 抗体阳性率最高分别为 31.2%、31.7%、24.5%、17.7%；各县（市）BVD、IBR 及 BRS 抗体阳性率相关性进行分析，BVD 的抗体阳性率与 BRS 的抗体阳性率在 0.05 水平上显着相关；系统聚类分析比较各县（市）地域之间的距离可发现，BVD、IBR 及 BRS 抗体阳性率的差异与地域差异之间无规律可循；各县（市）BVD、IBR 和 BRS 混合感染情况，BVD 的抗体阳性率除与 BRS 的抗体阳性率显着相关外，还与 BVD、IBR 混合感染，BVD、BRS 混合感染，IBR、BRS 混合感染，BVD、IBR、BRS 混合感染均显着相关；对不同地区的抗体阳性率统计分析，BVD、BRS 的抗体阳性率呈西高东低趋势，且两种病在不同地区的抗体阳性率存在显着相关，半山区、平原区和牧区的比较差异显着。
采用实时荧光 RT-PCR 检测方法复检不同牛场中抗体阳性血清样品是否含有病毒核酸。结果显示：IBR 检测中奶牛场阳性率最高为 26.8%；BVD 检测中屠宰场阳性率最高为7.3%；BRS 检测中奶牛场阳性率最高为 8.3%。
综合以上调查结果，具体地了解了吉林省 IBR、BVD、BRS 的流行情况，初步证实了这三种病在吉林地区的牛群中感染普遍，其中 IBR 的感染率较高。并提出相关的预防和控制建议，为减少这 3 种动物疫病的发生和流行提供数据支持，为这 3 种动物疫病的预防和控制提供了参考。
关键词：牛病毒性腹泻，牛传染性鼻气管炎，牛呼吸道合胞体，流行病学调查，防控。
ABSTRACT
To investigate the prevalence of bovine viral diarrhea (BVD), infectious bovine rhinotracheitis (IBR) and bovine respiratory syncytial (BRS) in Jilin Province, a total of 2200 serum samples (200 serum samples per counties) from cattle farms without immunization in 11 counties of 9 regions were detected by using the ELISAmethod and RT-PCR method.
ELISA kit was used to detect the positive antibody rate of BVD, IBR and BRS of different cattle farms. The results showed that the highest IBR antibody positive rates in beef cattle farms,dairy farms, slaughterhouses, and free-range households were 31.2%, 31.7%, 24.5%, and 17.7%,respectively. With the analysis of the correlation between BVD, IBR and BRS antibody positive rates in each county (city), the positive rate of BVD antibody was significantly correlated withthe positive rate of BRS antibody at 0.05 levels. With the systematic cluster analysis of comparing the distance between the counties (cities), there was no regularity between the difference of BVD, IBR and BRS antibody positive rates and regional differences. The mixed infection of BVD, IBR and BRS in each county (city) indicated that the positive rate of BVD antibody was significantly correlated with the positive rate of BRS antibody, the mixed infectionwith BVD and IBR, the mixed infection with BVD and BRS, the mixed infection with IBR and BRS, and the mixed infection with BVD, IBR, and BRS. The statistical analysis of antibody positive rate in different areas showed that the antibody positive rate of BVD, BRS were higher in the west and lower in the east, and there was a significant correlation between the two diseases in different areas. Significant difference was observed in the positive rate of antibodybetween the two diseases in the semi-mountain area, the plain area and the pastoral area.
RT-PCR method was used to detect whether the antibody-positive serum contained viral nucleic acid or not. Results showed that the highest positive rate of dairy farms in IBR test was 26.8%; the highest positive rate of slaughterhouse in BVD test was 7.3%; the highest positive rate of dairy farms in BRS test was 8.3%.
By summaring the above results, we could more specifically understood the prevalence of BIR, BVD and BRS in Jilin Province. It was preliminarily confirmed that the three diseases were common in cattle in Jilin and the infection rate of IBR was higher. The relevant prevention and control suggestions were proposed to provide data support for reducing the occurrence of the three animal epidemics, and to provide reference for the prevention and control of the threeanimal epidemics.
Key words: BVD, IBR, BRS, Epidemiological Investigation, Prevention and Control。
前 言
吉林省地域辽阔，有山地，半山区，草地、牧区等地形，其中草场资源总量为 8762万亩，是全国 8 大牧区之一。由于吉林省特殊的地理特征，其特点是东南部明显偏高，西北部偏低，可分为东部山区和中西部平原两大地貌区。不同的地貌形态导致了农作物耕作及饲养模式的不同。其中，东部山区分为长白山低山区和低山丘陵区。农耕面积偏低，主要以肉牛养殖为主，多采用春、夏、秋季放牧，冬季舍饲的饲养模式。中西部平原分为中部平原区和西部牧区,中部平原区为主要农耕区，以肉牛和奶牛养殖为主，多采用舍饲的模式；西部牧区为草地、湖泊、湿地、沙地，肉牛养殖多采用白天放牧，晚间补饲的方式，而奶牛养殖主要以舍饲为主。
在饲养品种方面，经过多年良种培育，吉林省既有延黄牛、草原红牛等地方培育品种，也有西门塔尔、利木赞、荷斯坦等改良品种。截止到 2017 年末吉林省牛存栏 337.56 万头，出栏 233.60 万头，在全国排名第六，其中奶牛存栏 25 万头位在全国排名第 13 位。然而由于各地区饲养历史及经济发展的差异，饲养模式、饲养规模、饲养品种及流通方式的不同，各地牛的传染病发病特征多有差异，特别是近年来牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体病、布鲁氏菌病及结核病等多种传染病给养牛场及个体户造成了巨大的经济损失。因此，在吉林省部分地区开展牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体病等病毒性传染病的流行病学调查及分析，了解这 3 种传染病在吉林省流行情况，发病特点，提出有针对性地防治措施，对全省牛病的防治意义重大。
第一篇 文献综述。
随着城乡居民收入的提高，牛肉及牛乳的消费比例也在稳步增长，导致牛肉价格持续攀升，养殖场及个体户的生产积极性也随之提高。作为畜牧业大省，吉林省肉牛及奶牛的存栏近年来显着提高，但包括牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体病等多种病毒性传染病同样有不断上升的势头。根据农业部颁布的《一、二、三类动物疫病病种名录》，牛传染性鼻气管炎被列为二类动物疫病，牛病毒性腹泻被列为三类动物疫病。牛呼吸道合胞体病虽未被列入，但流行范围正不断扩大，流行率明显提高。了解这 3 种牛病毒性传染病的发病特征、流行特点及诊断方法，是在吉林省部分地区开展流行病学调查与分析的基础，也是有针对性地提出防控措施的重要手段。
第一章 牛病毒性腹泻。
1.1 病原学。
1.1.1 概况。
牛病毒性腹泻（粘膜病）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus ,BVDV）引起一种以发热，消化道黏膜糜烂、溃疡和坏死，胃肠炎和腹泻为主要特征[1]的接触性传染病。该病各种年龄的牛都易感染，其中以幼龄犊牛易感性最高。1946 年 Olafson 等[2]在美国纽约首次发现该病存在，1953 年 Ramsey 等[3]在牛群中发现了一种以胃肠道广泛的溃疡为明显病变的牛病，因发病率低，死亡率高，遂命名为黏膜病(Mucosaldisease, MD) 。1971 年，美国兽医协会将这种病命名为牛病毒性腹泻/黏膜病，简称 BVD/MD。目前，BVD在世界范围内广泛分布，被多个国家列为必须净化的动物疫病。
1.1.2 牛病毒性腹泻分类地位。
根据 2005 年国际病毒分类的第八次报告将 BVDV 列为黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）成员，与猪瘟病毒（CSFV）和羊边界病病毒（BDV）同属，为瘟病毒属的代表病毒。
1.1.3 基因分型及基因组。
BVDV 分为两种生物型，非致细胞病变（NCP）和致细胞病变（CP），这取决于病毒是否会引起细胞的病理改变[4]。NCP 病毒在细胞培养中不引起细胞病变与正常细胞形态一样，CP 病毒可导致细胞形成空泡，核浓缩、溶解和死亡。根据病毒生物型分为急性、慢性和先天性感染等[5]。根据病毒基因组 5’非编码区（5’UTR）的序列，BVDV 分两个基因型 BVDV1和 BVDV2[6]。BVDV1可分为 11 种不同的基因型 BVDV1a-k，主要流行的亚型是 1a 和 1b，代表菌株分别为 NADL 和 Osloss 株；BVDV2的代表毒株是 890 株。BVDV1普遍用于疾病诊断和研究。
BVDV 基因组为单股正链 RNA，长 12.3~12.5Kb，包括 5’UTR、编码区和 3’UTR，分别编码 p14（C）、gp48（Erns）、gp25（E1）、gp53（E2）4 种结构蛋白和 p7、p10（NS4A）、p20（Npro）、p30（NS4B）、p58（NS5A）、p75（NS5B）、p125（NS2-3）8 种非结构蛋白。
其中，5’UTR 长 380~385bp，在各种病毒性腹泻病毒株种中高度保守，可用于病毒检测和分型的靶基因。BVDV1和 BVDV2的 5’UTR 差异率约 10%。
1.1.4 蛋白质组。
在 4 种结构蛋白中，由 BVDV 编码的前体蛋白 PrgP140经蛋白水解酶的切割和糖基化酶的修饰，被加工成病毒结构蛋白 C、Erns、E1和 E2。其中，Erns和 E2为糖基化蛋白[7]，可诱导机体保护性免疫反应。E2蛋白因含有病毒的主要的抗原决定簇，决定 BVDV 抗原反应并参与病毒的囊膜结构而具有最强的免疫原性，同时 E2蛋白还结合牛病毒性腹泻病毒抗体，介导免疫中和反应和宿主识别、吸附，成为目前研究的重点。
在 8 种非结构蛋白中，P125、NS4A、NS4B 和 NS5A 一起形成复制复合物，NS5B 是 BVDV的复制酶。在病毒复制过程中，P125、NS4A、NS4B、NS5A、和 NS5B 5 种非结构蛋白是必需的，而 Npro、p7、NS23 种非结构蛋白是非必需的。在 NCP 型感染细胞中，P125以成熟的蛋白形式存在，而在 CP 型感染的细胞中，除了稳定的 P125外还可以在其 1 个位点断裂产生 P45和 P80蛋白，有研究表明 P80在所有 CP 型感染细胞中均有存在，可能与病毒的致细胞病变作用有关。
1.2 流行病学。
1.2.1 传染源。
BVDV 感染的主要传染源是患病动物和带毒动物，特别是恢复期的牛可带毒 6 个月是潜伏的传染源[8]。对于感染了 BVDV 的妊娠牛可导致流产，其流产胎儿也会成为传染源。
在鼻液、唾液、精液、尿液、乳汁和眼泪等患病动物的排泄物和分泌物，脾脏和肠系膜淋巴结等急性感染期的组织中均可检测到 BVDV 的存在，在血清的中和抗体和白细胞层中也可分离到 BVDV。研究表明，妊娠牛在 50~150d 感染 BVDV，如能正常分娩，则出生后的犊牛持续带毒到成年[9]，且无明显的临床症状，因无保护性抗体还始终排毒和带毒成为该病最危险的传染源[10]。
1.2.2 传播媒介。
BVDV 可通过间接或直接接触的方式传播，一些吸血昆虫也是该病的传播途径，但主要是通过呼吸道和消化道感染传播，如采食被 BVDV 污染的水源和饲草而感染。胎儿的感染主要是通过母体垂直传播，含有病毒的精液，直肠检查不严格同样可以传播[11]。
1.2.3 易感动物。
所有的牛都是 BVD 易感动物，品种和年龄没有明显区分，一般 6~18 个月的犊牛最易感，肉牛比奶牛较易感[12]。
1.2.4 流行特点。
BVD 广泛分布于世界各地，呈地方性流行，在集约化封闭的饲养牛场中往往呈爆发式发病。该病一般在春季和冬末为高发期，对于一些老疫区隐性感染率约在 50%，且与新疫区相比急性病例较少。
1.2.5 国外 BVDV 流行状况。
1946 年 Olatson 等在美国纽约州首次报道 BVD 后，包括美国、加拿大、英国、澳大利亚、日本及其它非洲和欧洲国家都先后发现。20 世纪八九十年代，BVD 在北美的感染率为 50%~56%，秘鲁为 50%~90%；法国血清学阳性率为 76%。1994 年美国和加拿大相继发生致病性增强的 BVDV2疫情，导致牛急性出血性综合征，死亡率达到 25%。此外，BVDV1b 和 BVDV2b 在美国和加拿大也有流行。
1.2.6 我国 BVDV 的流行状况。
1984 年我国首次从流产胎儿脾脏中分离并鉴定出一株 BVDV，即 CC-184 株；1985年四川地区耗牛腹泻病料中检出该病毒，首次证明其在耗牛中的存在。2008 年国内研究单位第一次从牛体内分离到 BVDV2，证实了 BVDV2在我国的存在。随着养牛业的迅速发展，BVD 在我国东北、华北、西北、西南等地区均有报道，且流行呈上升趋势。
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1.3 临床症状及致病机制
1.4 检测技术
1.5 预防与控制
第二章 牛传染性鼻气管炎
2.1 病原学
2.2 流行病学
2.3 临床症状及致病机制
2.4 检测技术
2.5 预防与控制
第三章 牛呼吸道合胞体病
3.1 病原学
3.2 流行病学
3.3 临床症状
3.4 检测技术
3.5 预防与防控
第二篇 研究内容
第一章 吉林部分地区 3 种牛病毒性传染病血清学检测
1.1 材料与方法
1.1.1 主要仪器设备
1.1.2 检测试剂盒
1.1.3 样品采集
1.2 结果
1.2.1 蛟河市 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.2 柳河县 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.3 榆树市 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.4 农安地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.5 敦化地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.6 梅河口地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.7 长岭地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.8 梨树地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果2
1.2.9 通榆地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.10 公主岭地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.2.11 东丰地区 IBR、BVD 和 BRS 抗体检测结果
1.3 统计与分析
1.3.1 各县(市)BVD、IBR 及 BRS 抗体阳性率结果分析
1.3.2 不同地理区域 BVD、IBR 及 BRS 抗体阳性率相关性分析
1.3.3 各县(市)BVD、IBR 及 BRS 抗体阳性率相关性分析
1.3.4 各县(市) BVD、IBR 和 BRS 混合感染情况
1.4 讨论
1.4.1 各地区 BVD 流行情况分析
1.4.2 各地区 IBR 的流行情况分析
1.4.3 各地区 BRS 的流行情况分析
1.4.4 BVD、IBR、BRS 相关性分析
1.5 小结
第二章 吉林地区 3 种牛病毒性传染病分子生物学检测
2.1 材料与方法
2.1.1 主要仪器设备
2.1.2 样品来源
2.1.3 主要试剂
2.1.4 实验方法
2.2 结果
2.3 讨论
2.4 小结
结 论
1.本研究通过调查吉林省内的 11 个县（市）区抽查肉牛场、奶牛场、屠宰场、散养户检测 IBR、BVD、BRS 的抗体阳性率，了解每个县（市）区的抗体阳性率情况，统计 IBR、BVD、BRS 的总体平均抗体阳性率分别为 28%、8.3%、11.2%。
2.通过统计分析 BVD、IBR、BRS 在半山区、平原区、牧区不同的饲养模式和规模等，牧区的这三种病抗体阳性率最高，可能由于地理位置环境因素造成的，也可能是牧区饲养配套设施老化，还有就是传统的饲养模式没有科学化系统化的管理及饲养模式导致的。
3.BVD 的抗体阳性率除与 BRS 的抗体阳性率显着相关外，还与 BVD、IBR 混合感染，BVD、BRS 混合感染，IBR、BRS 混合感染，BVD、IBR、BRS 混合感染均显着相关。
4.吉林省内的 11 个县（市）区抽查肉牛场、奶牛场、屠宰场、散养户检测 IBR、BVD、BRS 的血清抗体阳性样品，进一步进行病原核酸检测 IBR、BVD、BRS 的总体平均阳性率为 17%、5%、6.5%。
参考文献
