中文摘要
汞（Mercury, Hg）是一种具有难降解、易迁移和高富集等特性的有毒重金属。自然界的汞主要以元素汞、有机汞和无机汞三种形式存在。氯化汞（Mercury chloride, Hg Cl2）被广泛应用于化学、电气及军事等领域并通过生物链的富集危害人类健康。研究表明，Hg Cl2可以造成多种器官损伤，脾脏是其毒性损伤的靶器官之一。硒（Selenium, Se）是机体所必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，具有抗氧化和拮抗重金属毒性的功能。已有研究表明Se可以拮抗重金属引起的鸡组织和器官损伤，但是Se能否拮抗Hg Cl2所致的鸡脾脏组织损伤及其具体的作用机制尚未阐明。因此，本课题拟探讨Se对Hg Cl2所致鸡脾脏损伤的保护效应及其作用机制。
本研究将90只1日龄雄性海兰褐蛋鸡适应1周后随机分为3组，每组30只。Cont组饲喂标准商品日粮和饮水；Hg Cl2组饲喂标准商品日粮和添加Hg Cl2的饮水（Hg Cl2含量为250 mg / L）；Hg Cl2+ Se组饲喂添加亚硒酸钠的标准商品日粮（Na2Se O3含量为10 mg / kg）及添加Hg Cl2的饮水（Hg Cl2含量为250 mg / L）。试验7周后处死试验动物并采集脾脏组织。
首先，通过检测脾脏指数和病理组织学变化来研究Se对Hg Cl2所致脾脏损伤的影响，结果表明Hg Cl2能诱导鸡脾脏指数显着降低以及脾脏组织病理损伤，Se有效缓解了脾脏的这种变化，结果证实Se拮抗Hg Cl2所致的脾脏损伤。其次，检测了脾脏组织中总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）等氧化应激相关指标。结果显示Se能有效缓解Hg Cl2所致的鸡脾脏MDA含量的升高以及GSH、GPx和T-AOC的下降，表明Se能拮抗Hg Cl2所致的脾脏氧化应激。再次，本研究检测了炎症相关指标IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12β、IL-13、IL-17、IL-18、TNF-α、NF-κB、COX-2及i NOS的m RNA水平和NF-κB、COX-2和i NOS的蛋白水平变化。结果显示Se能有效缓解Hg Cl2所致的脾脏IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12β、IL-17、IL-18和TNF-α、NF-κB、COX-2及i NOS的m RNA水平和NF-κB、COX-2及i NOS蛋白的表达水平的升高，及IL-10和IL-13 m RNA表达水平的降低。结果表明Se能有效拮抗Hg Cl2所致的炎症损伤。同时，本研究检测了凋亡相关指标Bak1和Bcl-2的m RNA水平和蛋白表达水平。结果表明Se能有效拮抗Hg Cl2所致的Bak1的m RNA水平和蛋白表达的升高及Bcl-2的m RNA水平和蛋白表达的降低。证实Se能有效缓解Hg Cl2所致的脾脏细胞凋亡。最后，检测了热休克蛋白HSP60、HSP70和HSP90的m RNA水平和蛋白表达水平，结果显示，Se能有效缓解Hg Cl2所致的HSP60、HSP70和HSP90的m RNA水平和蛋白表达的升高。结果证实Se拮抗Hg Cl2所致的鸡脾脏热休克蛋白的激活。
综上所述，Se主要通过拮抗氧化应激、炎症损伤、细胞凋亡和热休克蛋白的激活来缓解Hg Cl2所致的脾脏损伤。
关键词： 氯化汞；硒；氧化应激；炎症反应；细胞凋亡。
Abstract
Mercury (Hg) is a toxic heavy metal which difficult to be degraded, and is easy to be migrated and concentrated. There are three main types of mercury in nature includingelemental mercury, organic mercury, and inorganic mercur y. Mercuric chloride (Hg Cl2) is widely used in chemical, electrical, and military fields and has threats to human health by biological enrichment. It has been found that Hg Cl2 can cause a variety of organ damage, and the spleen is one of the target organs for its toxic damage. Selenium (Se) is an essential trace element of the body and an important part of glutathione peroxidase. It has the functions of anti-oxidation and previous studies have shown that Se can antagonize tissue and organ damage caused by heavy metals in chickens, however whether Se can antagonize spleen tissue damage caused by Hg Cl 2 and its specific mechanism has not been elucidated. Therefore,the objective of this study was to explore the protective effect of Se on the spleen injury induced by Hg Cl 2 and its mechanism.
In this study, 90 one-day-old male Hyland brown layer chickens were randomly divided into three groups with 30 in each group after one week of adaptation. The Cont group was fedwith standard commercial diets and drinking water. The Hg Cl2 group was fed a standard commercial diet and Hg Cl 2 supplemented drinking water (Hg Cl2 content was 250 mg / L).
The Hg Cl2 + Se group was fed a standard commercial diet supplemented with sodium selenite (Na2Se O3 content was 10 mg / kg) and added Hg Cl2 drinking water (Hg Cl2 content of 250 mg/ L). After seven weeks of the experiment, the test animals were sacrificed to collect spleen tissue.
Firstly, the effects of Se on spleen injury caused by Hg Cl2 were studied by the changes in spleen index and histopathology. The results showed that Hg Cl 2 induced a significant reduction in spleen index and pathological damage of spleen tissue. Se effectively relieved this change in the spleen, and the results confirmed that Se antagonized the spleen injury caused by Hg Cl 2 . Secondly, oxidative stress-related indicators were tested such as total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione peroxidase (GPx), glutathione (GSH), and malonaldehyde (MDA) in the spleen tissue. The results showed that Se effectively alleviated the increase of MDA level and the decrease of GSH, GPx and T-AOC levels in chicken spleen caused by Hg Cl 2. The results showed that Se could antagonize the spleen oxidative stressinduced by Hg Cl2. Thirdly, the m RNA levels of IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12β, IL-13,IL-17, IL-18, TNF-α, NF-κB, COX-2, i NOS and the protein levels of NF-κB, COX-2, i NOS were detected. The results showed that Se can effectively relieve the increase of IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12β, IL-17, IL-18, TNF-α, NF-κB, COX-2 and i NOS m RNA levels, and NF-κB, COX-2 and i NOS protein levels, and the decrease m RNA levels of IL-10 and IL-13 caused by Hg Cl2 . The results showed that Se can effectively antagonize the inflammatory damage caused by Hg Cl 2 . Fourthly, the m RNA levels of Bak1 and Bcl-2 and the protein levels of them were measured. The results confirmed that Se can effectively antagonize the increase of Bak1 m RNA level and protein expression and the decrease of Bcl-2 m RNA level and protein expression induced by Hg Cl 2 . It was suggested that Se effectively alleviated the apoptosis of spleen cells induced by Hg Cl 2 . Finally, the m RNA and protein expression levels of heat shock proteins HSP60, HSP70 and HSP90 were detected. The results showed that Se can effectively alleviate the up-regulation of HSP60, HSP70 and HSP90 m RNA levels and protein levels caused by Hg Cl 2. The results confirmed that Se antagonized the activation of heat shock protein induced by Hg Cl 2 in chicken spleen.In summary, Se can relieve spleen damage caused by Hg Cl 2 by antagonizing oxidative stress, inflammatory damage, apoptosis and the activation of heat shock protein.
Keywords: Mercury chloride; Selenium; Oxidative stress; Inflammatory response;Apoptosis。
1、前言
1.1、氯化汞。
1.1.1、氯化汞的理化性质。
汞（Mercury, Hg）的原子量为200.6，比重是13.6，凝固点是-38.9 ℃。汞是一种有毒的重金属元素，在自然界中主要以单质汞、无机汞和有机汞3种形态存在（Clarkson etal., 2002）。汞及汞的化合物容易引起动物及人中毒，无机化合物主要包括氯化汞（Hg Cl2）、砷酸汞和硝酸汞等，有机化合物有氯化甲基汞和甲基汞。其中氯化汞（Mercury chloride,Hg Cl2）又称氯化高汞，是一种白色粉末，常温下易挥发，300 ℃升华。遇光或者暴露在空气中容易分解和变质。
1.1.2、氯化汞污染的现状。
亚洲已成为大气汞排放量最大的洲，占全球排放量的一半以上。根据排放源类别的不同，将造成亚洲汞污染的行业主要分为：矿石开采、化工行业、金属冶炼以及煤炭行业等（Li et al., 2009），这些行业大量的汞排放对当地环境和人类健康造成了严重的损害。
近年来，中国采取了积极的措施控制大气污染，使大气中汞污染情况得到改善。这期间中国在控制汞排放方面取得了重要成就，中国的汞排放量从571吨减少到444吨。
控制煤矿企业减少汞排放被认为是控制汞污染最有效的措施。据了解，水泥制造和煤炭相关行业仍排放大量的汞，这一问题亟待解决（Liu et al., 2019）。
Hg Cl2被广泛应用于灯泡、气压计和美白化妆产品中，与我们的生活息息相关。
Hg Cl2污染的现象在日常生活中最常见的是废弃白炽灯灯泡对环境的污染，美白化妆产品中汞超标对人类健康造成危害。
1.1.3、氯化汞所致的器官毒性。
汞可损伤消化、呼吸、泌尿和神经等系统，导致动物中毒甚至发生死亡，各种动物均可发生。各种动物对汞的敏感性存在较大差异，牛和羊最为敏感，马和禽类次之，猪的敏感性最低。汞可通过食物链进入人体并在体内蓄积，当人类食用了汞污染的食物特别是海产品后即可发生中毒（Zhang et al., 2010）。从上个世纪50年代开始人类对汞的免疫毒性进行了大量的研究，其中包括免疫抑制和自身免疫性疾病的诱导等（Vas et al.,2008）。马子涵等人发现Hg Cl2可以对小鼠脾脏中的T细胞和B细胞以及树突状细胞的构成比例产生影响，结果证实汞诱导的自身免疫反应可能与降低调节性免疫细胞有关（马子涵，2015）。崔佳璐等人采取皮下注射和灌胃的方式研究Hg Cl2对小鼠机体造成的影响，结果发现脾脏重量明显增加，即Hg Cl2对脾脏造成了损伤（崔佳璐 等，2018）。
Tan等人证实Hg CI2能够诱导肾损伤（Tan et al., 2018）。武瑞等人在研究Se对Hg CI2所致雏鸡肝功能损伤的拮抗作用时发现Hg CI2中毒能够损伤肝功能（武瑞 等，2001）。马岩证实Hg CI2污染会导致Hg CI2在蛋鸡心脏、肺脏、脾脏、肝脏、肾脏、卵巢、肌胃和腺胃内沉积，同时随着饲粮中Hg CI2水平增加，Hg CI2沉积量随之提高（马岩，2019）。
1.2、氯化汞所致的器官毒性机制。
重金属的毒性机制主要包括炎症损伤、氧化应激、细胞凋亡及热休克蛋白的激活。
颜春鲁等人证实镉能够导致大鼠肾脏细胞发生凋亡（颜春鲁 等，2018）。
Wang等人在研究不同剂量的砷对鸡肾的影响时，发现砷暴露诱导氧化应激和炎症介导的肾毒性最终会通过线粒体依赖途径导致鸡肾脏的凋亡（Wang et al., 2018）。钟源霞等人证实砷暴露可以导致肝脏和肾脏发生氧化应激和细胞凋亡（钟源霞 等，2013）。
Wang等人研究证实过量的铅会导致鸡睾丸组织中诱导性一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）、核因子-κB（Nuclear factor-kappa B, NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosisfactor alpha, TNF-α）和环氧酶-2（Cyclooxygenase-2, COX-2）m RNA水平及NF-κB、i NOS、热休克蛋白60（Heat shock protein 60, HSP60）、热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）和热休克蛋白90（Heat shock protein 90, HSP90）蛋白水平的增加（Wang et al.,2017）。焦晓燕证实铅中毒能够导致鸡心脏组织损伤、氧化应激、细胞因子及热休克蛋白水平的激活（焦晓燕，2018）。
Nicholas等人发现当机体遭受甲基汞暴露时，Hg与酶结合使得机体内这些重要酶失去活力，无法维持机体的氧化还原平衡，从而造成机体损伤。补Se后，这些酶的活力得以恢复，从而使机体健康水平得以恢复（Nicholas et al.,2010）。
Hg Cl2所致的器官毒性机制也有报道，Yang等人在研究木犀草素拮抗Hg Cl2暴露引起的小鼠肝毒性作用机制时，证实Hg Cl2诱导肝脏发生氧化应激和炎症反应（Yanget al., 2016）。
Liu等人在研究木犀草素缓解Hg Cl2暴露所致的小鼠肺损伤时发现Hg Cl2诱导NF-κB通路的活化引起的肺脏炎症损伤。马岩证实饲粮中Hg CI2污染可以诱导蛋鸡肾脏发生细胞凋亡（马岩，2019）。
1.2.1、氧化应激。
动物机体的抗氧化系统，涉及酶系统和非酶系统。酶系统包括谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPx）、谷胱甘肽S转移酶（Glutathione-transferase, GST）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和过氧化物酶（Catalase, CAT）；非酶系统主要是谷胱甘肽（Glutathione, GSH）、VE和VC等。正常情况下机体内ROS（Reactiveoxygen species, ROS）的产生，主要通过线粒体呼吸途径、NADPH氧化酶体系、黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系和脂氧化酶体系等四个途径。常见的ROS分为过氧化氢、羟基自由基和超氧阴离子等三种形式。正常生理条件下，内源性的代谢可以产生ROS，机体内的抗氧化系统可以清除ROS并维持机体平衡。但是，当细胞内ROS的产生过多并且超过了机体的抗氧化应答能力时，这种平衡被破坏，导致了氧化应激的产生。活性氧作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛（Malondialdehyde, MDA）能引起蛋白质及核酸等生物大分子的交联聚合，具有细胞毒性，因此MDA被认为是发生氧化应激的标志。
柳羚研究发现铬暴露时小鼠肝脏氧化应激相关指标升高，MDA表达量上升，表明了铬可以导致小鼠氧化损伤（柳羚，2015）。傅晗等人发现镉暴露能导致大鼠肝脏ROS水平和MDA水平的升高，降低SOD和GPx活力，证实镉暴露能导致大鼠肝脏发生氧化应激（傅晗 等，2015）。杨凯发现过量铅诱导鸡免疫器官MDA含量升高，证实铅诱导鸡免疫器官发生氧化应激（杨凯，2016）。
Jiao等人研究发现铅能导致鸡法氏囊中总抗氧化能力（Total anti-oxidation capacity, T-AOC）、GPx及GSH活性降低和MDA含量增加，证实铅诱导鸡法氏囊发生氧化应激（Jiao et al., 2017）。陈大伟等人在研究酵母硒对铅暴露所致的蛋鸡卵巢损伤中发现铅可以导致GPx和GSH活性降低，MDA含量极显着升高，证实铅暴露导致鸡卵巢发生氧化应激（陈大伟 等，2016）。
Hg Cl2也能引起机体发生氧化应激，Thaís等人在研究Hg Cl2对大鼠心脏损伤机制中证实Hg Cl2暴露会导致心脏内皮细胞发生氧化应激（Thaís et al., 2018）。景友玲等人在研究Hg Cl2中毒与氧化应激反应之间的关系时，发现在家兔皮下注射Hg Cl2后家兔体内氧化应激反应加强氧化与抗氧化系统平衡遭到破坏，导致其发生全身脂质过氧化损伤（景友玲 等，2010）。
徐洪鑫等人在Hg Cl2诱导雏鸡肝脏组织发生脂质过氧化现象的研究中发现Hg Cl2暴露能导致鸡肝脏中MDA含量升高，GPx活性降低，证实Hg Cl2导致了鸡肝脏发生氧化应激（徐洪鑫 等，2002）。
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1.2.2、 炎性反应，
1.2.3、细胞凋亡.
1.2.4 、热休克蛋白.
1.3、硒
1.3.1、 硒的理化性质
1.3.2、 硒拮抗重金属器官毒性的机制.
1.3.3、 硒拮抗汞毒性的研究.
1.4、 研究目的与意义
2、材料与方法.
2.1、 试验对象
2.2、主要试剂
2.3 、主要仪器
2.4、相关试剂的配制
2.4.1、氯化汞配制方法.
2.4.2、组织固定液配置方法
2.4.3 、10X w estern Blot电泳缓冲液配制方法
2 4.4 、10X Western Blot转膜缓冲液配制方法
2.4.5、 10X TBS溶液配制方法
2.4.6 、1X TBST工作液配制方法.
3、结果与分析.
3.1、脾脏指数的变化
3.2 、脾脏病理组织学观察
3.3、硒缓解氯化汞所致的脾脏氧化应激.
3.4、硒对氯化汞暴露脾脏中炎症标志指标mRNA水平的影响.
3.5、硒对氯化汞暴露脾脏中炎症标志指标蛋白水平的影响
3.6、硒对氯化汞暴露脾脏中炎症相关细胞因子mRNA水平的影响.
3.7、硒对氯化汞暴露脾脏中凋亡指标mRNA水平的影响.
3.8、硒对氯化汞暴露脾脏中凋亡相关蛋白水平的影响.
3.9、硒对氯化汞暴露脾脏中热休克蛋白相关指标mRNA水平的影响
3.1.0、硒对氯化汞暴露脾脏中热休克蛋白相关指标蛋白水平的影响.
4、讨论
4.1 、硒拮抗氯化汞所致鸡脾脏氧化应激.
4.2、硒拮抗氯化汞所致鸡脾脏炎症损伤
4.3、硒拮抗氯化汞所致鸡脾脏细胞凋.
4.4、硒拮抗氯化汞所致鸡脾脏热休克蛋白的激活，
5、结论
本课题通过建立雏鸡Hg Cl2中毒模型，选用Se作为保护剂，重点探讨了Se对Hg Cl2所致鸡脾脏损伤中的保护作用。并且证实了Se对Hg Cl2所致的脾脏损伤确实有保护作用并且其机制有如下几点：
（1）硒拮抗氯化汞所致的脾脏氧化应激；
（2）硒拮抗氯化汞中所致的脾脏炎症损伤；
（3）硒拮抗氯化汞所致的脾脏细胞凋亡；
（4）硒拮抗氯化汞所致的脾脏热休克蛋白的激活。
6. 参考文献.
