摘 要
禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza Virus，AIV)感染多种动物的一种急性高度接触性传染病。NA是禽流感病毒粒子表面的重要抗原，在病毒复制过程中发挥重要作用。近年来，家禽H5N6亚型禽流感疫情不断爆发和人感染H5N6亚型禽流感病例的出现，H5N6亚型禽流感才开始被关注。目前，我国报道的有关N6亚型禽流感病毒有H3N6、H4N6、H5N6和H6N6等。本实验室前期从临床健康鸭中分离出H6N6亚型禽流感病毒，本研究拟在此基础上，开展H6N6亚型禽流感病毒贵州株NA基因的克隆和序列分析、原核表达与多克隆抗体制备以及贵州省N6亚型禽流感血清学调查，以期为贵州省N6亚型禽流感的防控提供基础数据。
1．禽流感N6亚型基因克隆及序列分析。
根据Gen Bank(登录号为KJ484613)禽流感病毒N6基因序列设计特异性引物，对贵州地区分离的H6N6亚型禽流感病毒贵州株进行N6基因的克隆与测序分析，结果显示：4株H6N6亚型禽流感病毒贵州株N6基因的编码区大小均为1380 bp，可编码459个氨基酸，其中从第175-207位缺失33个核苷酸，即编码蛋白颈部存在11个氨基酸缺失(TNSTTTIINN)； 贵 州 株N6基 因 的 核 苷 酸 同 源 性 为96.0%~99.1%， 其 中A/duck/Guizhou/01/2017(H6N6)与A/duck/Guizhou/02/2017(H6N6)为 同 一 分 支 ，A/duck/Guizhou/03/2017(H6N6)和A/duck/Guizhou/04/2017(H6N6)为另一分支；N6亚型毒株与其他非N6亚型毒株明显位于两大分支。
2．禽流感N6亚型基因的原核表达与多克隆抗体制备。
回收H6N6亚型禽流感病毒贵州株A/duck/Guizhou/02/2017的N6基因扩增产物，克隆到原核表达载体PET-32a(+)，转化E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，His-tag镍柱亲和层析纯化N6基因表达蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体，Western-blot检测表达产物的反应原性，结果显示：N6基因表达蛋白主要以包涵体形式存在，蛋白分子量约为70 k Da；表达的重组蛋白能被His抗体和兔源NA抗体所识别。
3．贵州省N6亚型禽流感血清学调查。
以原核表达的N6蛋白为包被抗原，采用ELISA对2016年至2017年收集的813份鸡血清样本进行N6蛋白抗体检测，结果显示：在813份鸡血清样本中有186份为阳性，阳性率为22.88%，其中：2016年N6蛋白抗体阳性率为9.76% (20/205)，2017年N6蛋白抗体阳性率为27.30% (166/608)，阳性率呈现上升趋势。
综上所述，本实验成功对H6N6亚型禽流感病毒贵州株N6基因进行了克隆测序分析、原核表达与多克隆抗体制备和N6亚型抗体检测分析，提示贵州省N6亚型禽流感感染有上升趋势，这对贵州省N6亚型禽流感的预防与控制奠定了科学的基础数据。
关键词： 禽流感病毒；N6基因； 序列分析；原核表达；血清学调查。
Abstract
Avian influenza (AI) is a highly contagious infectious disease infected by many kinds of animals by Avian influenza Virus (AIV). NA is an important antigen on the surface of avian influenza virus particles, which plays an important role in the process of virus replication. In recent years, the outbreak of avian influenza H5N6 subtype and the infection in human hav been reported, so avian influenza H5N6 subtype has begun to be concerned. At present, avian influenza viruses N6 subtype reported in China include H3N6, H4N6, H5N6 and H6N6. In our laboratory, the avian influenza virus H6N6 subtype was isolated from the clinical healthy ducks. In this study, the the NA gene of the avian influenza virus H6N6 subtype Guizhou strain was cloned and sequenced, and expressed in the prokaryotic cells and used for the preparation of the polyclonal antibody and the serological investigation of the N6 subtype avian influenza, which provides the basic data for prevention and control of the N6 subtype avian influenza in Guizhou Province.
1. Cloning and sequence analysis of avian influenza virus N6 gene。
According to N6 gene sequence of avian influenza virus in Gen Bank(NO.KJ484613), the specific primers were sesigned and synthesized, and used for amplification and sequenceanlysis of the N6 gene of avian influenza virus isolated from Guizhou prevince. The results showed that the coding region of the N6 gene were 1380 bp in 4 strains of H6N6 subtype avian influenza virus, which could encode 459 amino acids, from which lack 33 nucleotides from 175 to 207 sites, there are 11 amino acid deletion (TNSTTTIINN) in the neck of the encoded protein. The nucleotide homology of the N6 gene in Guizhou strain is 96.0%~99.1%,of which A/duck/Guizhou/01/2017 (H6N6) and A/duck/Guizhou/02/2017 (H6N6) are the same branch, but A/duck/ Guizhou/03/2017 (H6N6) and A/duck/ Guizhou/04/2017 are the other branch. The N6 subtype strain were obviously located in different branche with thenon-N6 subtype strains.
2. Prokayotic expression of NA gene and preparation of polyclonal antibody。
The amplification products of N6 gene of A/duck/Guizhou/02/2017 strain were reclaimed and cloned into prokaryotic expression vector PET-32a (+), and conversed into E.coli BL21 (DE3) and expression induced by IPTG. The expressed protein were purified by affinity chromatography of His-tag column, and used for preparation of polyclonal antibody in rabbit, then the antigenicity of the N6 gene product were detected by Western-blot. The results showed that the expression form of N6 gene was mainly inclusion body, which themolecular weight of the expressed protein was about 70 k Da. the recombinant protein were identified by His antibody and NA antibody from rabbits.
3. Serological survey of N6 subtype Avian influenza in Guizhou Province。
Using the prokaryotic expression N6 protein as the envelope antigen, 813 of the chicken serum samples, which collected in chicken farms from 2016 to 2017, were detected by ELISA. The results showed that 186 of the chicken serum samples were positive, which the positive rate was 22.88% (186/813), in which the positive rate was 9.76% (20/205) in 2016, and 27.30% (166/608) in 2017. These results indicated the positive rate was increased in the N6 subtype avian influenza.
In summary, the N6 gene of avain influenza virus were cloned and sequenced, and expressed in the prokaryotic cells and the polyclonal antibody of N6 protein were preparated,and the N6 subtype antibody were detected and analyzed, which suggested that the infection of N6 subtype avian influenza has a rising trend in Guizhou province. These results provides the scientific data for the prevention and control of N6 subtype avian influenza in Guizhou Province.
Key words: Avian influenza virus; N6 gene; sequence analysis, prokaryotic expression;serological investigation。
文献综述
1、禽流感研究概况
1.1、禽流感历史。
禽流行性感冒(Avian influenza，AI)简称禽流感，是由禽流感病毒(Avian influenzaviruses，AIV)引起的一种烈性传染病，该病病原属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒(Schafer W，1955)。1878年，Perroncito等人首次报道了禽流感病毒在意大利引起鸡瘟，1901年Centannic等人确定禽流感的病原为病毒，随后几十年，人们逐渐发现了人类和其他动物的流感病毒，直到1955年才鉴定该病毒为A型流感病毒。1981年，鉴于过去所称的“鸡瘟”一词常引起鸡新城疫和禽流感的混淆，便废除了“鸡瘟”这个名称，在第一次国际禽流感会议上正式命名为禽流感。自1878年首次报道禽流感以来，该病已呈全球分布，在许多国家和地区都有特定的毒株引起禽流感的爆发和流行，而每次禽流感的爆发几乎都给当地的养禽业带来沉重打击，造成无法估量的经济损失。禽流感不仅可以在家禽中传播，甚至可以通过家禽传染人类，威胁人类健康。高致病性禽流感(HPAI)属于国际兽医局动物流行病组织(OIE)法定报告的动物疫病(Henningson JN，2015)。1992年，我国农业部将禽流感列为《家畜家禽防疫条例》甲类检测传染病。
1.2、禽流感在我国流行情况。
我国最早报告禽流感疫情是在1980年，徐为燕在南京禽类加工厂中，随机采集了86只鸭泄殖腔拭子进行检查，其中有15例分离出A型AIV感染。1991年，我国大陆地区首次证实H1N1亚型猪流感病毒感染病例(郭元吉，1992)。1992年陈伯伦等(1994)在广东省某鸡群中发现有H9亚型AIV感染病例。1996年，唐秀英等(1998)从发病鸡群中分离出2株H4N6和3株H9N2亚型AIV；同年又从鹅体内分离出3株H5N1和H14N5病毒，这3株H5N1病毒均为高致病力毒株。1997年4月，香港3个鸡场4 800只鸡突然死亡，检验结果为H5N1亚型AIV感染所致，5月，一名3岁儿童死于雷耶氏综合症及肺炎合并症，在其气管分泌物中分离出一株H5N1病毒，截止1998年2月，该毒株引起了18人患严重呼吸疾病，其中6人死亡，此次禽流感的发生被称为“香港禽流感事件”，该事件中约150万只家禽被扑杀，直接耗资6千万港元，用于养禽业的补贴高达10亿港元。于康震等人通过AI血清学调查，发现221个AI阳性鸡群，H9亚型鸡群占93.6%，证实了我国已普遍存在中等毒力以下的AI，这将给我国养禽业造成巨大威胁。2004年以前，我国内地一直没有报道高致病性禽流感病例，但自2004年以后我国多次报道多起家禽高致病性禽流感事件和人感染高致病性禽流感事件：
2004年1月27日，广西隆安县宣布发生高致病性禽流感，截止当年2月19日我国公布有16个省市超过40个县、市(区)报告发生了高致病性禽流感，这次疫情共确诊高致病性禽流感23起，疑似15起，直接经济损失2亿人民币，间接损失不可估量，后经鉴定为H5N1亚型禽流感。2006年宁夏银川、2007年湖南松江县和广东省广州市均发生了H5N1亚型高致病性禽流感事件、2009年新疆和田地区也发生H5N1亚型高致病性禽流感事件。高致病性禽流感的发生与流行，给我国家禽养殖业造成了巨大的经济损失。
由于我国处在多条国际候鸟迁徙路线上，而候鸟特别是野鸭是天然的AIV储存库，容易将AIV传播到我国区域内，再通过当地栖息的候鸟、水禽等将AIV传播到家禽养殖场，这使我国成为禽流感流行的中心之一。
1.3、 N6亚型禽流感在我国流行情况。
早在1976年，香港就已分离到一株H3N6亚型禽流感，后又在内陆7个省份中不断分离到H3N6，宿主主要以鸭源为主，但也有从鹌鹑、企鹅、鹅、鸡中零星分离到；2004年至今，H4N6亚型AIV在我国黑龙江、山东、上海等11个省份从禽类中检测到H4N6亚型AIV，宿主基本为鸭。2002年~2007年，仇保丰等(2009)在华东地区家鸭体内分离到6株H4N6亚型低致病性禽流感，2010年云南分离到2株低致病性的H4N6亚型AIV(李昀海，2011)，此次为云南首次分离到H4N6亚型AIV，且发现点位于候鸟迁徙区域。彭宜等(2009)在我国盐城珍禽自然保护区野鸭中分离出H4N6亚型的重组病毒，推测可能是候鸟携带毒株与其他AIV毒株重组而得。其他报道(许传田，2012；杨德全，2012)显示，基因遗传多样性的H4N6亚型禽流感毒株，可能是来源不同的流感病毒基因在鸭体内经过复杂重组演变来的重组病毒。目前，H3N6、H4N6亚型AIV在我国报道并不多见，大都从鸭源中分离检测出，少部分也从鸡、鹅、鹌鹑中分离检测出，虽H3N6、H4N6遗传变异很慢，但还是存在一定变异，值得我们注意。
2013年，江苏省一个活禽市场在AIV的监测中首次发现了H5N6亚型AIV，2014年哈尔滨一鹅场大量家禽死亡，后经鉴定为H5N6亚型AIV，2015年4月，香港首次野鸟中分离出H5N6亚型AIV，同年5月广东清远发生一起H5N6亚型AIV疫情，大量家禽死亡。自2014年来，我国四川省南充市出现第一例人类感染H5N6亚型AIV致死病例后(Zhang.RS，2016)，随后在我国广东、云南、湖南、湖北、江西、安徽、深圳等地出现多次人感染致死病例，在2017年12月福建有一例人感染H5N6流感后康复出院，目前还没有证据表明H5N6流感病毒可以在人与人之间持续传播。
相比而言，我国目前流行最广泛的为H6N6亚型AIV。1980年美国首次在蓝翅鸭体内分离到H6N6亚型禽流感毒株。2001-2016年在我国福建、贵州、江苏、浙江、安徽等地在禽类或野生鸟类中检测到H6N6亚型AIV，H6N6亚型AIV从2007年起遍布于我国11个省，宿主范围广，除水禽，鸡以外，包括猪和斑鸠。其中广西从2007年以来，几乎每年都会分离检测出H6N6亚型AIV。2010年，在广东从猪体内分离到H6N6亚型的AIV(Gen Bank：HM04474)，这说明H6N6亚型AIV虽为低致病性禽流感，但也开始突破种群屏障，从家禽鸟类向其他物种传播。
目前分布在我国的N6亚型禽流感病毒包括H1N6、H2N6、H3N6、H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、H10N6、H13N6等9种亚型，其中主要以H3N6、H4N6、H5N6、H6N6为主。在禽流感病毒所有已知亚型中，只有H5和H7亚型引起过高致病性禽流感，但并非所有H5和H7亚型都具有致病力。出现较多的便是大家熟知的H5N1、H7N9，然而从2014年至今，H5N6也不再陌生，H5N6亚型高致病性禽流感是在1975首次从美国绿头鸭体内分离到H5N6亚型AIV(Garcia.M，1977)，但当时并未引起人们足够重视，国内自2013年也陆续开始报道有分离(Qi X，2014；Bi YH，2015)，直到2014年四川首次发现一例人感染H5N6亚型流感病毒并致死病例，这是我国出现的第一例人感染H5N6(Zhang RS，2016)，才开始引起广泛关注。随后又在我国多地引起人感染致死病例。近几年H5N6亚型禽流感疫情较普遍，对养殖户造成巨大损失。
在NCBI里搜索发现我国H5N6的NA基因序列有187个，分离于我国18个省(自治区)和3个特别行政区。从WHO公布数据中，分析发现我国H5N6亚型禽流感主要集中华南、华中、华东、西南地区。据研究报道，H5N6并非一种新型病毒，只是流感病毒的一种，对H5N6亚型病毒的遗传进化分析表明，该亚型病毒是由广泛存在于野鸭中的H5N1和H6N6 2种亚型病毒基因交换而来(Bi YH，2016)，在中国南部H5N6已经取代了H5N1的主导AIV亚型，特别是鸭子。H3N6、H4N6、H6N6亚型AIV虽为低致病性流感，但在我国流行的趋势亦不亚于H5N6亚型AIV，由于是低病性禽流感，所以带来的危害以及造成的影响远低于H5N6亚型禽流感。H5N6疫情遍布氛围均比上述亚型更广，宿主范围也不再是传统的水禽、鸡、鸟、企鹅，开始突破屏障，猪、猫、孔雀等也存在感染H5N6亚型禽流感。2016年，广西中越边境地区，在活禽市场检测分离到1株H1N6亚型禽流感病毒(熊文婕，2018)，NA基因的遗传进化分析发现，分离株与江西的一株H5N6(Gen Bank登录号：KX51178)同源性较高，提示该分离株NA基因与人源H5N6亚型流感病毒NA亲缘关系较近，2016年在安徽检测分离到H6N6的NA基因与当前流行的H5N6优势株的NA基因有着密切联系(葛志闯，2017)。综上可见，对N6亚型禽流感的进一步研究仍是非常有必要。
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2、方法
2.1、 禽流感N6亚型基因克隆及序列分析.
2.1.1、引物设计
2.1.2、目的基因的扩增
2.1.3、目的基因克隆和测序
2.1.4、目的基因序列分析.
2.2、禽流感N6亚型基因的原核表达与多克隆抗体制备.
2.2.1、原核表达重组质粒的构建
2.2.2、 NA基因的原核表达、纯化及鉴定
2.2.3、抗N6多克隆抗体的制备
2.3、禽流感N6亚型抗体检测.
2.3.1、禽流感N6亚型抗体检测方法建立
2.3.2、血清样本检测.
3、结果
3.1、目的基因PCR扩增结果.
3.2、目的基因克隆和鉴定结果.
3.3、目的基因生物信息学分析结果.
3.3.1、 AIV贵州株N6基因同源性分析.
3.3.2、 AIV贵州株N6基因遗传进化分析.
3.3.3、 AIV贵州株N6基因编码蛋白变异分析结果
3.4、原核表达质粒PCR鉴定及酶切鉴定结果.
3.5、重组蛋白质表达、纯化与鉴定结果
3.6、抗N6多克隆抗体的制备结果
3.6.1、兔源多克隆抗体的制备结果
3.6.2、抗N6多克隆抗体Westernbloting鉴定结果
3.7、禽流感N6亚型抗体检测结果
3.7.1、禽流感N6亚型抗体检测方法建立结果
3.7.2、血清样本检测结果.
4、讨论.
4.1、关于禽流感N6亚型基因克隆及序列分析
4.2、关于禽流感N6亚型基因的原核表达
4.3、关于重组NA蛋白的应用研究
4.4、关于多克隆抗体的制备.
4.5、关于N6亚型禽流感抗体检测
全文结论
1. 成功克隆了4株H6N6亚型禽流感病毒贵州株N6基因(Gen Bank登录号MG43499、MG43500、MG43501和MG43502)，大小均为1380 bp，可编码459个氨基酸，其中从 第175-207位 缺 失33个 核 苷 酸 ， 即 编 码 蛋 白 颈 部 存 在11个 氨 基 酸 缺 失(TNSTTTIINN)；4个毒株间N6基因核苷酸同源性为96.0%~99.1%。
2. 成功构建了A/duck/Guizhou/02/2017(H6N6)(Gen Bank No.MG434500) NA基因的原核表达载体PET32a-N6，并得到了良好的表达，表达蛋白的分子质量为70 k Da；该重组蛋白可诱导家兔产生良好的免疫应答反应。
3. 以原核表达的重组N6蛋白为包被抗原，初步建立了检测N6抗体的ELISA检测方法；用以检测近两年贵州收集的鸡血清样本发现，N6亚型抗体的检出率呈现上升趋势。]
参考文献.
