中文摘要
β神经生长因子促蒙古马排卵的初步应用
在繁育季，从业人员对母马进行系统的繁育健康检查（BSE），尤其是评估母马的发情鉴定和排卵时机对于提高受精率尤为重要。马的排卵过程受内分泌系统和神经系统共同调节。近年来，利用促排激素及合成类似物预测排卵的临床应用较为广泛，但我国地方马品种的详细超声应用、繁育健康检查、促排激素水平测定情况及排卵前优势卵泡直径阈值等相关数据信息严重缺乏。研究发现，作为神经营养因子家族的β神经生长因子（Nerve growth factor-Beta，NGF-β）不仅作用于神经系统，而且对生殖系统也有重要调节作用。NGF-β在水牛、鸡和绵羊等不同动物的颗粒细胞和卵细胞上均有表达，且在羊驼和骆驼精浆中作为主要诱排剂，但其在马繁育方面的应用仍很少。因此，从NGF-β角度初步探讨其促进蒙古马排卵的相关应用研究，具有一定的科学意义。
体内实验首先对94匹蒙古母马进行BSE，统计发现56匹母马排卵前48-72 h优势卵泡直径平均值为35.8 mm。其次，挑选出BSE正常的42匹年轻母马和2匹h CG耐受的母马，当优势卵泡达到35 mm，最后进行NGF-β促排应用（Ⅰ+Ⅱ）。其中NGF-β剂量及给药途径（包括肌肉注射，静脉注射和子宫内灌注）的筛选试验（Ⅰ）为NGF-β注射促排应用试验（Ⅱ）提供最佳给药方案。在NGF-β注射促排应用试验（Ⅱ）中通过比较12匹母马（n=3）在四个发情期里肌肉注射0.5mg NGF-β、马精浆粗液、1.0 mg地洛瑞林和等量生理盐水后促排情况，另外2匹h CG耐受母马给予肌肉注射2000 IU h CG、0.5 mg NGF-β、1.0 mg地洛瑞林和等量生理盐水探究母马促排情况。母马促排应用的结果主要根据直肠超声检查监测卵泡排卵情况进行判定。
蒙古马血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成激素（LH）及NGF-β含量的测定试验、马精浆蛋白SDS-PAGE试验、马输卵管NGF-β及其受体Trk A免疫组化试验和NGF-β促进蒙古马卵母细胞体外成熟的体外试验，以体外培养原代蒙古马卵丘-卵母细胞复合体（COC）为切入点，添加50 ng/m L NGF-β处理后评估卵母细胞体外成熟培养情况。体外实验探讨蒙古马的内分泌激素规律以及正常排卵指标，研究NGF-β是否存在于蒙古马输卵管和精浆中，以及是否促进蒙古马卵细胞成熟。
NGF-β剂量及给药途径的筛选试验（Ⅰ）结果显示1.0 mg和0.5 mg剂量给药组中除子宫内灌注组外，其余实验组促排率达100%（P<0.01）。最适NGF-β剂量为0.5 mg，给药途径为肌肉注射，为NGF-β注射促排应用试验（Ⅱ）最佳给药方案。结果表明：蒙古母马优势卵泡达到35 mm后，经肌肉和静脉途径注射等剂量NGF-β促排效果无明显差异，均促排良好。0.5 mg NGF-β与常规Gn RH激动剂类似物（地洛瑞林）相比促排效果相近。NGF-β具有作为母马促排剂的潜力且对耐受h CG母马促排有效，但蒙古马精浆粗液及子宫输注NGF-β促排效果差。研究发现蒙古马精浆中存在NGF-β。NGF-β及其受体Trk A在发情期和间情期的蒙古马输卵管上均有表达，且发情期表达量高于间情期。由于仅一个马卵母细胞培养成熟，该部分未能作为结论。
本研究阐述和实操的母马繁育健康检查（BSE）对从业人员进行马繁育临床实操具有重要的意义。描述蒙古马的内分泌激素以及正常排卵指标，对马的基础繁育生物学的知识有所贡献。探究活性NGF-β是否有潜力成为马促排卵剂，为后续开发兽药、诊疗，尤其对h CG耐受母马的诊疗应用以及后续马繁育研究开展提供一定程度的参考价值。
关键词： β神经生长因子，母马促排，繁育健康检查，排卵预测，繁育直肠超声应用。
Abstract
The Application of Nerve Growth Factor-Beta in Promoting Ovulation of Mongolian Mares
The importance of breeding soundness examination (BSE), especially evaluates the estrus and ovulation timing of mares for breeders in breeding seasons can never be underestimated, particularly when it comes to increasing fertilization rates. Ovulation process is regulated by endocrine system and nervous system. The effects of hormones in endocrine system on mare’s ovulation have been fully studied, so was the clinical application of hormones on accurately predicting ovulation. However, specific to the local equine breeds in China, the detailed ultrasonic application of BSE of hormone levels and the pre-ovulation follicle diameter threshold were rarely systematically described. Nerve growth factor-Beta (NGF-β) is a part of the neurotrophic factor family. In recent studies, NGF-β has been found to act not only on nervous system, but also on reproductive system. It was expressed on granulosa cell and oocyte in different animals, such as buffaloes, chicken, and sheep. NGF-β is a major component of alpaca seminal plasma and induces ovulation in female alpacas and camelids, but there is still very little research on equine; Therefore, based on previous research, the research was significantly conducted to pilot explore the application of NGF-β in promoting ovulation of mares.
In vivo experiments were carried out on Mongolian mares by using BSE and NGF-β promoting ovulation application (Ⅰ+Ⅱ). Breeding soundness examination (BSE) of 94 Mongolian mares was conducted, and the average 35.8 mm value of 56 mares of the dominant follicles, 48 to 72 hours before ovulation was calculated. Forty-two young mares with normal BSE results and 2 h CG-tolerant mares were selected as the main subjects of NGF-β promoting ovulation application (Ⅰ+Ⅱ) . In the pilot study(Ⅰ),when the mare dominant follicles reached 35 mm, Pre-examination of different administration routes (intramuscular injection, intravenous injection, and intrauterine infusion) and dosage of NGF-β was performed in groups and provided the best dosing regimen for the NGF-β injection application experiment (Ⅱ). In the experiment of NGF-β injection application (Ⅱ), when 12 follicles (n=3/group) of the mare reached35 mm, they were intramuscularly administered with stallion crude seminal plasma,0.5 mg NGF-β, 1.0 mg deslorelin and equivalent amount of 0.9% saline to promote ovulation during four estrus cycle. To study their ovulation, the other two h CG-tolerant mares were injected with 2000 IU h CG, 0.5 mg NGF-β, 1.0 mg deslorelin and equivalent amount of 0.9% saline. The results were judged by rectal ultrasound monitoring of follicular ovulation.
In vitro experiments were the determination of the follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and NGF-β in Mongolian mare’s serum, the SDS-PAGE test of stallion crude seminal plasma protein, NGF-β of mare fallopian tube Trk A immunohistochemistry test and NGF-β promoted Mongolian horse oocyte maturation test in vitro which using the primary Mongolian horse cumulus-oocyte complex (COC) cultured in vitro, after adding 50 ng/m L NGF-β assess the maturation of oocytes. In vitro experiments explored the endocrine hormone law and normal ovulation index of Mongolian mares, whether NGF-β was present in the oviduct and seminal plasma of horses, and whether it promoted the maturation of Mongolian oocytes.
The screening experiment of NGF-β doses and administration route (Ⅰ) that in the 1.0 mg and 0.5 mg doses administration groups, except the intrauterine infusion group, the rest of the experimental group had 100% ovulation rate (P<0.01). The optimum dosage regimen of Ovulation Induction Experiment with NGF-β Injection (II) should be intramuscular injection with 0.5 mg NGF-β. It turns out that when the dominant follicle of a Mongolian mare reached 35mm, ovulation induction was effective by whether intramuscular or intravenous injection with the same dosage of NGF-β,which is not significantly different. NGF-β (0.5 mg) had a similar ovulation promoting effect to general analogues of Gn RH agonist (e.g. deslorelin). NGF-β, with ovulation induction potential, is effective in promoting the ovulation of h CG-tolerant mares. Stallion crude seminal plasma and intrauterine infusion had poor effect. The study discovered that NGF-β exists in seminal plasma of Mongolian horses. NGF-β and its receptor Trk A were expressed on oviducts of mares during estrus and diestrus,and the expression during oestrus was higher than that during dioestrus. Since only one equine oocyte matured in culture, this part could not be concluded.
Breeding soundness examination(BSE) is significant to clinical application of practitioner. Describe basic clinical and endocrine parameters and normal ovulation of Mongolian horses, which can be a contribution to the general knowledge of equine reproductive biology. The research explored whether NGF-β can be an ovulation induction agent, and serve as important references to the development of veterinary drugs, diagnosis and treatment, especially for the treatment of h CG-tolerant mares and will contribute to follow-up horse breeding research.
Keywords: Nerve growth factor-Beta, ovulation induction in mares, breeding soundness examination, ovulation prediction, breeding rectal ultrasound application。
引 言
马产业里，繁育是支撑整个产业链的基础。以纯血马赛马产业链为例子，其有四大环节，分别是最基本的育马场繁育育种（Breeding）、拍卖会等交易（Auction Sales） 、 练 马 师 马 匹 赛 事 调 训 （Pre-trainning） 以 及 赛 事（Racing）。繁育是循环链中最基础的环节，尤其在英国起源的赛事规则（Stud book）中，规定纯血马只允许自然交配（Live cover），不可人工授精（Artificial insemination, AI）。这决定了珍贵种马资源的繁育质量等需得到高度保障，以确保母马平安且马驹顺利出生。马是自发性排卵动物，无论是否有公马的交配刺激，母马在发情期都会自发排卵，由于公马不能精确地预测排卵的时间，因此自然交配妊娠率低。母马有特殊的生殖解剖结构例如排卵窝（fossa），再加上排卵预测较难，双胞胎妊娠对母马而言非常危险，常规母马促排不能朝着超数排卵方向发展。多数母马的优势卵泡在发情期结束前24-48小时内排卵，最佳的交配时间为排卵前后12小时左右[1]。综上原因，在母马繁育中为提高受精率，预测马排卵及促进卵泡发育，尤其促进优势卵泡排卵在马繁育研究中极具意义。我国不乏地方良马马种，其中蒙古马既作为世界名马之一又作为我国北方地区特有的马遗传资源，国内一直有做马育种保种工作，但在系统的繁育健康检查和研究上仍落后。以雌激素为主的作用下，从业者主要依据母马发情期卵泡软硬程度及生殖道变化，常采取触诊手段预测马匹排卵，老前辈们的经验总结借鉴异常珍贵，但对于应对规模产业化而言就显得普及性不足。马繁育预测排卵中对卵泡大小最直观的评估是通过直肠超声扫描检查监测卵泡生长情况。西方国家关于超声技术预测马排卵的应用可追溯到20世纪80年代[1]，有关促排激素调节马内分泌系统的研究亦十分透彻。其中，持续使用人绒毛膜促性腺激素（h CG）促排因母马产生抗体而存在效果降低的情况。虽然Gn RH激动剂类似物（地洛瑞林（Deslorelin），布舍瑞林（Buserelin）和组氨瑞林（Histrelin）等）在马繁育临床应用普遍，但在中国市场未见有商品化Gn RH激动剂类似物的投入，部分地区仍在使用易使母马产生耐受的h CG进行促排。
再有，在牧区地区难以保障药物存储及运输。国外母马繁育生理学指标，预测排卵经验虽可以参考借鉴，但蒙古马具体国产蒙古马全面的促排激素水平值还尚不明确，所在纬度和繁育季时间、生活环境和国外品种马不一样，环境温度总体而言较低，可能导致出现发情期更长，个体差异排卵规律更难摸索，卵泡直径更大等现象。因此探究新的微量高效且低成本的促排卵成分及方法将对没有超声设备的普通牧民及基层从业人员马繁育临床应用具有重要的意义。
NGF-β在基础研究层面，已有很多有关繁育作用研究。NGF-β广泛表达于各类动物卵巢细胞、卵巢颗粒细胞中。本文临床应用以NGF-β促进羊驼排卵临床试验文献应用为参照[2,3]。实验室部分，涉及促排激素FSH、LH水平检测，NGF-β在生殖系统中大致定位定量实验，包括免疫组化和ELISA试验。系统阐述兽医在马发情期如何对母马进行系统的繁育健康检查(BSE)，可以更好地预测马排卵。本实验临床部分涉及BSE临床操作，对56匹蒙古母马优势卵泡排卵前阈值进行统计，并筛选出最适正常年轻母马作为蒙古马NGF-β促排应用（Ⅰ+Ⅱ）实验对象。
NGF-β剂量及给药途径的筛选试验（Ⅰ）选出最佳给药途径及NGF-β剂量，NGF-β注射促排应用试验（Ⅱ）以肌肉注射Gn RH激动剂类似物（地洛瑞林）为阳性对照，以0.9%生理盐水为阴性对照，以及母马自身前后发情期排卵情况比对，以母马直肠触诊及超声检查进行排卵确认并分析NGF-β及蒙古马精浆对母马促排临床应用的作用。
第一篇 文献综述。
1、母马的繁育健康检查概述。
母 马 的 繁 育 健 康 检 查 （BSE） 又 称 为 繁 育 评 估 检 查 （Reproductiveevaluation），要求从业人员熟识母马解剖学结构、马繁育生理学等。繁育健康检查包括母马的理化检查、马的外生殖器区域外观评估、马阴道及子宫检查、发情鉴定与排卵预测、记录马繁育史、繁育管理等，目标是对母马生殖潜力做出评估，找出与生育率下降相关的异常状况，提供治疗或管理方案。对个体母马系统的繁育健康检查以确保母马生殖健康，为后续受精做准备。
一份完整的繁育史需要记录：发情史，母马目前生产状态（初胎，当季未孕，怀孕或已产驹），上一繁育季BSE检查的情况，往日配种产驹基本信息，曾使用繁育技术及繁殖辅助技术（人工授精，本交或群配）以及所有发情周期呈现的异常情况，繁殖系统传染病史，子宫感染，胚胎死亡或流产史等[4]。
1.1、马卵巢和子宫解剖学结构。
卵巢是母马生殖系统的主要器官，负责卵细胞发育和内分泌调节，通过激素调控发挥作用。马有两个卵巢（左右各一个），通常呈现类肾形状，但卵巢的具体形状和大小取决于优势卵泡发育程度以及排卵状态。卵巢在繁殖季节最大（春季和夏季），在非繁殖季节最小（冬季乏情期）。卵巢的平均大小为长6至8 cm，宽3到4 cm，平均重量是70到80 g。卵巢位于毗邻的每个子宫角的末端，位于腰部以下区域（位于第四或第五腰椎），被长条状的阔韧带悬挂。右卵巢通常比左侧大2至3 cm，因为右卵巢可能被大肠顶起，它在体内的实际位置相当多变。因此，为了便于在每次直肠触诊时定位卵巢，建议检查人员先找到每个子宫角的末端再顺着捋到相关的卵巢[8]。卵巢皮质和人类的卵巢皮质部分刚好呈相反排布，如图1.1所示，且有特殊的排卵窝结构，排卵窝是母马卵巢凹面的楔形区域，由一层短的多边形细胞（生发上皮）覆盖，是卵巢中唯一可以排卵的部分。优势卵泡成熟后从排卵窝排出[32]，为此从业者可通过直肠触诊或超声检查来检测排卵窝排卵。每个卵母细胞被卵巢内称为卵泡的特殊结构包围。卵泡具有双重作用，是卵子形成（Gametogenic）和内分泌（雌激素）的重要组成部分。与公马可持续产生精子的情况不同，母马在成年后不会再产生新的卵母细胞。随着卵泡的生长，卵泡内形成充满液体的腔室。母马处于发情期时，优势卵泡直径平均每天以3-5 mm的速度发育，多数母马在发情期中只显示出一个优势卵泡，但是少部分母马可同时出现两个优势卵泡[9]。排卵前24小时卵泡的生长速度会减慢，最后在卵泡直径达到成熟阈值后进行排卵。排卵时，卵泡靠近排卵窝后破裂，释放卵泡液和卵母细胞，卵母细胞被输卵管接收，并沿输卵管漏斗向远侧输送至壶腹部等待受精，之后卵泡被暂时的黄体腺替代。
马的优势卵泡直径最终可达35-60 mm，其大小通常与马品种，体型大小和个体差异有关。例如表2所示，从中等体格的夸特马和阿拉伯马到纯血马最后到大型挽马常见优势卵泡最终从35-60 mm[10]逐渐变大，排卵前卵泡直径阈值也相应增大。卵泡液全部排空的流失时间受个体差异影响较大，可达0-5小时不等[7,33]。
随着卵泡排卵塌陷，数小时（8至12小时）后卵泡腔因毛细血管内壁破裂而充满血液，形成红体（CH）。在接下来的几天中，红体通过颗粒细胞和卵泡膜细胞浸润，血凝块的纤维蛋白浸入，伴随结构和激素水平的变化，这些细胞的生理变化等过程称为黄体化。红体变成黄体（黄体化）会在长度和形状方面产生变化，从而导致超声图像上黄体的横截面形状发生很大的变化，加大了不规则性。黄体化的过程导致类固醇激素的产生，雌激素和雄激素转变为孕酮。这些黄体化细胞的快速增殖导致黄体（CL）的形成。在黄体早期发育期间，黄体可能充血，可能从排卵窝延伸至腺体，形似蘑菇状。若此时母马未受精，在子宫内膜细胞不断分泌的前列腺素作用下，黄体逐渐衰退（约12-14天）[1]，母马逐步进入下一个发情周期，上述过程可以应用直肠超声技术的卵巢超声图像所识别。
多数优势卵泡在发情期结束前24-48小时内开始排卵。而最佳的交配时间为排卵前后12小时左右。人工授精（冻精）最佳配种方案取决于冻精的可用量以及解冻后精子的活性。精子和卵子分别进入壶腹部以及在母马生殖道内受精活性均有自身时间限制，因此，为提高授精率，授精与排卵的时间间隔尽可能保证短，从业人员在母马排卵后立即授精可能是最理想的[10]。
母马的黄体腺根据其形态和发育通常被分为红体，黄体和白体（Corpusalbicans）如图1.5所示。母马会形成一个红体，中央有一个血块样外观，红体（CH）是排卵后形成的短暂充血结构，CH通过颗粒细胞和卵泡膜细胞侵入卵泡壁而发展成黄体。母马排卵后的几天内在排卵窝周围开始形成黄体组织，母马的成熟黄体直径为2-3 cm。黄体组织呈小梁状或折叠状外观。折叠状外观可能是由于优势卵泡的排卵塌陷所致，卵泡壁被折成朝中央腔突出的褶皱。有些母马的黄体发育涉及整个卵巢结构，成熟的黄体虽然通常呈现折叠状，但外表坚实。黄体增生伴随着组织和最终血凝块的收缩。血凝块组织包含网状纤维结构，这通常是超声解剖学的一个显着特征。当黄体发生衰退萎缩时，由于血管减少和结缔组织增多，腺体的外观颜色会变浅，变成白体。组织密度的增加同时也改变了超声图像结构，在随后的发情期中，白体的消退继续进行。最终色素沉着成为朝向排卵窝的条纹，但该过程无法通过超声识别。
母马的子宫呈T字型，有分泌上皮细胞排列，并具有厚厚的肌肉层。子宫上皮为纤毛细胞和分泌细胞的柱状上皮，子宫解剖学结构如图1.2所示。超数排卵（Super Ovulation，SOV）常见于双侧[30]，母马卵巢双侧排卵的可能性很低。
母马不同于猪，羊可以应用超数排卵以满足多胚胎移植的妊娠需求，有效的母马超数排卵技术是为母马提供生殖辅助技术，从而为胚胎移植（ET），配子输卵管内移植（GIFT）和卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）等技术提供多个卵母细胞和多个胚胎，从而提高其成功率。超数排卵会增加正常和不育母马以及使用不育种马精液的母马的妊娠率[31]。母马妊娠仍然是单胎成活率远高于双胞胎及多胞胎。母马妊娠期平均为330到350天左右，由于母马子宫空间不足，怀孕双胞胎40天后，大约80%随后会中止妊娠或在妊娠晚期（8个月）流产，胎儿恶性竞争母体营养，产弱胎等[1]，兽医需要及时终止母马双胞胎妊娠。熟识母马生殖解剖学结构是繁育健康检查（BSE）的前提，是视诊，触诊，超声检查技术应用的基础。
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1.2、马的发情周期及激素调节
1.3、马的理化检查
1.4、马的外生殖器区域外观评估
1.5、马阴道及子宫检查
1.6 、马的发情鉴定.
1.7、马的排卵预测.
2 、β神经生长因子
2.1、 NGF-β简述
2.2、NGF-β在排卵中的作用.
第二篇 实验内容
第一章 NGF-β促进蒙古马排卵的体内实验.
1、材料
1.1、实验动物.
1.2、主要药物及配制说明
1.3、仪器设备
2、实验方法
2.1、NGF-β促进蒙古马排卵的体内实验的流程图及概述
2.2、母马初步马繁育健康检查(BSE)
2.3、蒙古马NGF _β促排应用( I+II )
3、结果
3.1、母马外生殖器区域外观评估
3.2、马发情鉴定及排卵预测
3.3、 异常母马统计
3.4、 NGF- β剂量及给药途径的筛选试验( I )
3.5、 NGF- β注射促排应用试验(II)
4、讨论.
5、小结
第二章 NGF-β促进蒙古马排卵的体外实验.
1、材料
1.1、试验材料.
1.2、实验试剂配制
2、实验方法.
2.1、蒙古马血清中FSH、LH及NGF β含量的测定试验.
2.2、马输卵管NGF . β免疫组化试.
2.3、NGF-β伲进蒙古马卵母细胞体外成熟试验.
2.4、蒙古马精浆蛋白SDS-PAGE试验.
3、结果
3.1、 蒙古马血清中FSH、LH及NGF- β含量的测定
3.2、马输卵管NGF -β免疫组化试验.
3.3、蒙古马卵母细胞体外成熟试验.
3.4、蒙古马精浆蛋白SDS-PAGE
4、讨论.
5、小结.
结 论
1. 蒙古马优势卵泡排卵前48-72 h的阈值（35.8 mm）与体型相近的夸特马品种相似。
2. 蒙古马优势卵泡达到35 mm后，经肌肉和静脉途径注射等剂量NGF-β促排效果无明显差异，均促排良好，但子宫灌注给药途径的促排效果差。
3. 0.5 mg NGF-β与常规剂量的Gn RH激动剂类似物（地洛瑞林）相比促排效果相近，其具有作为母马促排剂的潜力且对耐受h CG母马促排有效。马精浆粗液虽具有一定促排效果，但促排率低，效果不如同等条件下注射纯化NGF-β及地洛瑞林的促排效果。
4. 研究发现蒙古马精浆中存在NGF-β。NGF-β及其受体Trk A在发情期和间情期的蒙古马输卵管上均有表达，且发情期表达量高于间情期。
参考文献
