胰酶对猪腹泻病毒S蛋白作用的最新成果综述

　　猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（porcineepid emicdiarrhea virus,PEDV）引起的一种以仔猪腹泻、呕吐和脱水为主要临床症状，最终破坏电解质平衡导致病猪死亡的的一种急性腹泻病[1].

　　PEDV属套式病毒目，冠状病毒属，有囊膜，囊膜上包裹着花瓣状的纤突。其基因组为不分节段的单股正链RNA病毒，大小在28~30kb,由七个开放阅读框（ORF）编码三个非结构蛋白（ORF1a、ORF1b和ORF3），四个结构蛋白：S蛋白（纤突蛋白）、E蛋白（小膜蛋白）、M蛋白（膜糖蛋白）和N蛋白（核蛋白）。
　　
　　其中，S蛋白在病毒的融合机制、组织嗜性和致病性等多方面发挥重要作用。然而本次流行毒株S基因多引入9个碱基的变异，致使新型毒株大范围流行，对于PED新毒株的分离，再次成为焦点问题。目前，研究发现胰酶在PEDV分离中被广泛应用，因为胰酶可裂解S蛋白，使其在体外感染Vero细胞，并且随着胰酶的浓度增加PEDV感染效果越明显[2].而胰酶在PEDV分离中与S蛋白的作用机制仍然不是很清晰，本文将通过介绍胰酶对S蛋白作用的最新研究进展，为以后新型PEDV分离和疫苗研究提供参考。

　　1PEDV的变异及传播

　　1971年PED首次在英国报道，随后遍及欧洲和亚洲各国。2010年以后PEDVS基因S1区N端碱基出现15个碱基插入和6个碱基缺失，比对发现这些突变区碱基多为T和C的互相转换。该毒株随后流行于中国、韩国、泰国和日本等国家。然而，现有疫苗株CV777与其同源性为96.9%,导致疫苗防治无效[3].2013年美国23个州爆发疫情，2014年德国报道PED的流行，且流行毒株与变异毒株同源性更高[4-5].PEDV变异毒株的出现，导致大量仔猪的死亡，使其成为业界关注的热点。

　　PEDV的变异很可能与冠状病毒的S蛋白进化性有很大联系，是冠状病毒适应新环境所产生的进化。同为冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒PRCV-ISU-1株也在S蛋白的N端有227氨基酸的缺失，从而改变了该病毒的组织嗜性[6].Gao等发现流行我国华东和华北的流行毒株与与韩国毒株更相似，而南方地区的毒株又与泰国流行毒株关系更近[7].泰国学者也曾分析发现，新型PEDV爆发的很大原因来自猪肉和骨粉等原料的进口，从而使病毒在泰国传播[8].同样在美国爆发疫情后，墨西哥和加拿大也随即出现该病的报道，因此这种地缘位置和经济贸易，可能是该病传播的重要途径。

　　2S蛋白及其功能

　　S蛋白也称纤突蛋白，即Ⅰ类冠状病毒融合蛋白，主要负责病毒的吸附和融合。S蛋白由4152个核苷酸编码1383个氨基酸组成，被分成N端S1区（1~789氨基酸）和C端S2区（790~1383氨基酸），S1区主要作为受体，S2是膜融合的功能区[9-10].S2区又分为三个亚区，包括胞外区、跨膜固定区（TM）、胞质尾区（CT）。胞外区有胰酶切割位点，S1和S2共同作用促进PEDV感染细胞，而这个感染过程需要在胰酶的辅助下完成。S基因的胞外区也是病毒粒子的毒力基因，然而近几年世界流行的毒株几乎全部在S基因N端170~171bp位点插入CAGGGTGTCAAT和413~414bp插入ATA共计15个碱基并在479~480bp缺失TGGGGAA.

　　通过比对发现S基因有198个左右核苷酸发生突变，其中发生在S1区内突变占73.3%.SunR等学者将2010-2012年我国分离到PEDV流行株的S基因与2010年以前的毒株进行序列比对，发现新分离的毒株在S基因也在相同位点发生了15个碱基的插入和6个碱基的缺失。这种变化可能潜在的改变了PEDVS基因抗原性，因为PEDV抗原中和表位（COE499-638aa）存在S基因内[11].日本学者报道过的83p-5毒株在传代的过程中，发现34代和61代出现的18个碱基变化在100代仍存在，致使83p-5株S蛋白信号肽、S1和S2的膜外区发生突变，导致该毒株对仔猪致病性减弱[12].

　　综上可知，病毒毒力的改变和S基因上的碱基变化有很大联系。而近年流行的变异毒株与疫苗CV777株相比，在S基因N端共计多出9个碱基的变化，使S蛋白上的糖基化位点、毒力基因、细胞培养特性和跨膜螺旋都发生了变化[13].因此S基因的变异情况更能体现PEDV的整体变化情况。

　　S蛋白作为Ⅰ类融合蛋白在感染过程中尤为重要，它是冠状病毒膜融合进入细胞的功能蛋白，S蛋白经胰酶等处理，可转变为膜融合蛋白[14].通过胰酶裂解的S蛋白易发生构象改变促进膜融合。

　　我国学者使用LJB/03毒株对猪氨基肽酶N（pAPN）转染到MDCK细胞中表达，发现S蛋白能与猪小肠上的pAPN发生受体结合，并证实pAPN为PEDV的感染性受体[15].这个结合过程很可能是胰酶把S蛋白裂解成S1和S2两个结构域，S1识别细胞表面受体pAPN,激活信号肽上的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，S2区在刺激下执行S蛋白的构象转化与细胞膜发生融合[16].但是pAPN受体是不存在Vero细胞上的，所以很可能PEDV感染细胞不只是通过这一种途径或者有不同的功能性受体。

　　2010年以后由于S基因共计9个碱基在S1区的插入，可能潜在的改变了PEDV对细胞的适应性和胰酶促进PEDV融合的位点。

　　3胰酶对S蛋白的作用

　　3.1胰酶改变S蛋白构象PEDVS蛋白具有Ⅰ类融合蛋白所具有的共同特征包括融合蛋白N端相同的融合肽位点和C端以螺旋形式包围的三螺旋结构，从而使S蛋白形成一种亚稳的三聚体形式存在。病毒的这种结构，在特定因素的刺激下就会与受体发生融合[17].因此大多数病毒的分离都需要借助胰酶的作用，例如禽流感病毒、人冠状病毒229E（HCoV-229E）、非典型肺炎（SARS-CoV）、鼠肝炎病毒（MHV）和PEDV等[18-19].Kazuya等报道PEDV在体外感染Vero细胞时只有存在胰酶样物才能形成多核体，促进细胞间融合[20].而在缺少外源蛋白酶的情况下，PEDV也可通过胞内体途径并利用内源组织蛋白酶激活S蛋白进行膜融合。冠状病毒一般利用S蛋白的融合作用进入细胞，通过囊膜与细胞膜融合和胞吞两种途径。然而病毒感染细胞过程是需要利用胰酶改变S蛋白的构象促进病毒与细胞发生融合。首先病毒上的融合蛋白诱导病毒与靶细胞的融合，结合作用后暴露融合肽使靶膜与细胞膜紧密接触，这时融合肽周围的脂质分子进行重排，最后通过中间体过度发生融合。而胞吞机制被认为是pH敏感的过程，但是直接的膜融合是不依赖pH值[17,21-22].研究证明HCoV-229E通过胰酶和组织蛋白酶L的裂解后，可有效的促进膜融合，这种感染过程与SARS-CoV侵入细胞是有共同特征的[23].Matsuyama证实冠状病毒的S蛋白经过两次构象的变化，并在胰酶介导下可发生膜融合。通常是因为S蛋白含有特征性的保守七肽重复区（HR），包括HR-C和HR-N.病毒在融合过程中HR-N常形成一个内部的三聚体卷曲螺旋结构与三个HR-Cs以反并联的方式结合，最终形成六螺旋体（6HB），这种结构易与细胞膜贴近利于膜融合的发生[24].最新研究显示，发现真实的六螺旋体直接在细胞膜上耦合形成，更加暗示着通过六螺旋体的结构促进病毒与细胞的融合[25-27].PEDV融合机制完全与同类冠状病毒感染的过程是相同的，它们都是通过胰酶作用改变S蛋白结构，使病毒形成易于融合的六螺旋体结构，促进病毒感染[14].

　　3.2胰酶触发S蛋白的融合机制冠状病毒是囊膜病毒，它的融合过程可利用多种途径。例如在受体结合后可利用酸性环境或胰酶水解激活S蛋白，从而使融合肽与靶膜融合，这个过程都是由S蛋白调控的[28].Judith等学者根据结构标准确定了四种不同的激发病毒融合蛋白通过构象变化的机制，但是各种病毒融合蛋白都经历"完全融合→嵌膜的同源三聚体发卡前体→三聚体发卡（也称作六螺旋体）"等相同的结构转化，最终促进病毒与细胞膜融合[29].Shutoku也曾报道病毒融合多采用两步法，受体在中性pH时被激活，随后通过酸性环境完成膜融合。所有Ⅰ类融合蛋白在病毒表面就以一种亚稳的三聚体形式存在，这种结构通过跨膜区固定在病毒的囊膜上，经过酸性环境诱变亚稳三聚体即转换成发夹前结构中间体，暴露融合肽与细胞膜双分子层结合[21].然而冠状病毒S蛋白转化成六螺旋体结构，是需要利用胰酶裂解完成的，因为有学者研究发现PEDV胰酶分离株CV777相比细胞适应株DR13（培养无需胰酶）在胰酶裂解后S蛋白的S2'位点保留一个精氨酸（R）残基，而DR13该位点的R突变为甘氨酸（G），但是大多数冠状病毒的S2'位点是R,这样就可以合理解释为什么DR13可以不依赖胰酶培养[30].结合以上研究发现，即使不同的病毒融合过程有略微的区别，但是通过胰酶或者酸碱度作用后都会形成稳定的融合结构。这就预示病毒具有相同的融合结构，而冠状病毒作为最大的RNA病毒需要胰酶的刺激才可形成六螺旋体，是因为S蛋白S2'位点R的存在，而胰酶成为触发这种结构变化的关键因素，所以PEDVS蛋白通过胰酶裂解才可发生构象改变。

　　3.3胰酶促进PEDV感染细胞大多数冠状病毒都可以诱发体外感染的细胞发生细胞间的融合，Hingley报道冠状病毒MHV-2在感染细胞时，经胰酶处理可以观察到合胞体的形成[31].有研究证实PEDV和牛冠状病毒接种细胞同样在胰酶处理下，可观察到多核体的形成。但是PEDV感染细胞形成合胞体，只有在胰酶处理后才可以观察到明显的细胞病变。而不经胰酶处理PEDV是不能有效的在培养细胞中增殖，形成细胞病变[17,32-33].
　　
　　这是因为PEDV进入细胞时，胰酶会使S蛋白形成易于融合的构象，增强病毒对Vero细胞吸附，促进融合活动的发生。随着病毒感染并增殖，临近的细胞发生相互融合，形成细胞病变。Park报道利用10μg/mL胰酶在接种前分别对PEDV、Vero细胞进行预处理10min和在接种后立即加入胰酶，PEDV感染的效果不同。在对细胞和病毒分别预处理不会增加病毒的滴度，然而在接种时加入胰酶会明显使病毒渗透到细胞内。胰酶只会在PEDV吸附细胞时，诱导膜融合的发生，增加病毒的感染[34].因此在对PEDV分离过程中掌握合适胰酶处理的时间段会影响病毒的有效分离。

　　有研究表明分别利用胰酶和丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2）处理接种PEDV后的Vero细胞病毒滴度明显增高，而且能形成明显的多细胞融合体，Shirato学者曾利用病毒已经感染的Vero细胞在无胰酶的条件下，培养3d后短暂的加入胰酶发现感染的病毒立即从细胞表面释放到培养液，经实验证明是外源的胰酶提高细胞培养液中病毒的滴度，显示胰酶才是使病毒从感染的细胞中释放的关键因素[20,28].因为PEDV感染的细胞上没有蛋白酶的存在，病毒粒子在感染的细胞表面以簇或聚集体的形式存在，通过随后的胰酶处理才使病毒粒子释放到细胞培养液中[35].这种现象表明是胰酶的作用，使病毒有效的从细胞中释放。胰酶的这种作用与神经氨酸酶（NA）促进禽流感病毒从感染的细胞表面上受体释放的过程是相同的[36].胰酶的这些作用非常有助于PEDV的分离和其致病机制的研究[20].

　　在动物体内内源性蛋白酶如弗林蛋白酶、质膜蛋白酶和内溶酶体蛋白酶等，都能有利于PEDV的S蛋白裂解，促进其感染肠上皮细胞[28,37].PEDV在体外分离需要借助胰酶的修饰，其实是模拟体内感染过程中病毒粒子借助内源性蛋白酶的作用感染靶细胞。在PEDV的繁殖过程中胰酶是病毒感染和释放所必需的，日本学者通过长满单层Vero细胞的24孔培养板中，使用MK毒株接种，并设置了存在胰酶和无胰酶的两种条件，接种后用PBS代替培养液，检测发现在胰酶存在条件下PEDV的滴度是无胰酶的1000倍左右。随后又分别把已经感染病毒的Vero细胞，用无胰酶的培养液在37℃温箱中培养三天，弃掉培养液利用PBS冲洗2次，在室温用胰酶处理5min.通过荧光定量PCR检测发现胰酶处理后的培养液病毒浓度明显比不经胰酶处理的高[20].所以PEDV野毒株分离培养是严格需要体外的胰酶处理，病毒才会有效的感染细胞，促进病毒的增殖和加快细胞病变的形成，最终胰酶使病毒粒子从细胞表面释放。总之，胰酶在病毒感染和释放中的一系列作用，暗示其在PEDV野毒株分离过程中扮演至关重要的角色。同时这可能预示着体内蛋白酶会使PEDV介导的腹泻感染加重。

　　如果是这样，对于PEDV的防控，蛋白酶抑制剂会是一种理想的治疗药物。

　　4胰酶在PEDV分离中的应用

　　PEDV从开始流行经历了十多年的时间Hoff-man等通过利用Vero细胞在胰酶存在的条件下培养出PEDV[38].然而至今，仍然没有稳定分离培养的方法。多数学者都是尝试利用在培养液中加入胰酶，通过上述胰酶可促进构象变化的作用分离病毒。目前多采用Vero细胞作为病毒分离的宿主，因为它能抵抗高浓度胰酶的作用，同时满足PEDV感染对胰酶的需求。Kadoi等学者在PK、ST、CPK和ESK等细胞在培养液中添加胰酶成功培养了PEDV,并可以产生明显的细胞病变[39].Liu等报道PEDV通过在细胞培养液中加入5μg/mL胰酶，成功的在人源细胞系Huh-7,MRC-5生长并能产生明显的CPE[40].2013年美国学者通过在培养液加入5μg/mL胰酶利用Vero细胞也成功的分离出两株新型PEDVISU13-19338E和ISU13-22038[41].因此，可以通过试验的目的和阐明的问题，选择PEDV适应的细胞系且结合胰酶的作用，找到PEDV野毒株稳定分离培养的方法。

　　5结语

　　上述资料表明，目前研究已经证实胰酶通过裂解PEDVS蛋白使其形成易于融合六螺旋体构象，这个胰酶结合位点是在S2'的精氨酸残基。随着病毒的增殖，胰酶又可促进病毒从感染细胞中释放，结合胰酶一系列作用可表明胰酶是PEDV体外融合、感染和释放的关键因素，且结合其体内和体外相同的感染机制，也为PEDV积极防治提供了新思路。通过对胰酶在病毒分离培养中作用的研究进展，胰酶很可能是通过如下机制发挥作用：①胰酶裂解PEDVS蛋白激活信号肽通路，促使S1和S2与细胞膜受体结合发生细胞膜重排，产生易于感染细胞的六螺旋体结构；②胰酶作为一种标准的丝氨酸肽链内切酶能与被裂解的冠状病毒S蛋白上具有S2'精氨酸残基的功能性受体结合，从而促进融合反应的发生。希望在以后的研究中能最终揭示这一反应机制。