猪流行性腹泻病毒毒株遗传进化分析

　　猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的急性高度接触性肠道传染病,各种年龄的猪均可感染,以哺乳仔猪发病和死亡最为严重。

　　PEDV属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus),基因组为不分节段的线性单股正链RNA,靠近3′端5kb区域内有5个主要的开放阅读框,编码有典型的冠状病毒结构蛋白:N蛋白、M蛋白、sM蛋白和S蛋白;ORF3蛋白位于sM蛋白和S蛋白之间,编码224个氨基酸多肽,是PEDV基因组编码的唯一1个辅助蛋白。该病于1971年首次在英国报道,后相继在比利时、德国、瑞士、日本等国家报道,我国在1976年首次报道并分离毒株。随后,中国使用欧洲株CV777的灭活苗或减毒苗进行防控,极大地减少了该病的发生。但自2010年冬至2011年初,我国华南、华东和华北等地区开始暴发严重的仔猪腹泻疫情,哺乳仔猪表现水样腹泻、呕吐等主要临床特征和肠道出血的主要病理特征,发病猪场哺乳仔猪的发病率100%,死亡率在80%以上,尤其是5日龄内的仔猪,死亡率高达100%,给我国养猪业带来巨大经济损失。为能更好地预防和控制该病暴发和流行,有必要对该病病原PEDV进行基因遗传进化分析。

　　Chen等对12株中国不同地区的野毒株进行ORF3基因的分析,表明中国毒株与韩国毒株有很近的遗传进化关系,而且远离PEDV疫苗株。

　　Yang等分析15株PEDV毒株的ORF3基因和M基因,表明在中国新近流行的PEDV毒株有了一定程度的 变异和进化,是一个新的基因型。

　　Gao等通过分析15株PEDV毒株的S基因和M基因发现,新流行的毒株在S基因上有一个共同的特征。近几年,PEDV ORF3蛋白的功能逐步被揭示,Wang等证明其是一种离子通道蛋白,当ORF3基因的表达受到抑制后,病毒在Vero细胞上的产量明显降低;当PEDV毒株适应细胞后,ORF3基因发生改变,PEDV的毒力也随之降低;Park等通过ORF3基 因的遗传进化树分析,证明ORF3基因可以作为区分高度适应细胞的弱毒株与野毒株的遗传标记,而且ORF3基因也可以作为猪流行性 腹泻分 子流行病 学调查的一个有效的工具。由此可以看出,ORF3基因的确与PEDV的毒力相关,采用ORF3基因研究新近流行PEDV毒株的遗传变异规律具有可行性。目前尚未见到对全国所有分离的PEDV流行毒株的遗传进化分析报道。笔者对浙江某地及全国范围内流行的PEDV毒株进行遗传进化分析,旨在了解国内PEDV流行毒株的遗传进化状况,为新发PEDV的研究提供参考依据。

　　1、材料与方法

　　1.1试验样品及处理

　　2011年12月于浙江某猪场采集的49份腹泻仔猪的肛门试子,用pH 7.4PBS缓冲液适当稀释,反复冻融3次,-80℃保存备用。

　　1.2引物设计与合成

　　基于GenBank上发表的PEDV的ORF3基因序列,利用Primer premier 5.0软件设计引物,上游引物:5′-CCTAGACTTCAACCTTACGA-3′,下游引 物:5′-CAGGAAAAAGAGTACGAAAA-3′,扩增片段长度为774bp,引物由上海生工生物技术有限公司合成。

　　1.3 RNA抽提

　　按照Trizol reagent说明书进行操作,抽提的RNA溶解在20μL RNase-free的DEPC水中,并储存在-70℃冰箱。

　　1.4 ORF3基因扩增

　　25μL反转录系统包含PEDV RNA 10μL,10×Buffer 5μL,2.5mmol/L dNTP 4μL,PEDV下游引物1μL,M-MLV反转录酶1μL,RNA酶抑制剂0.5μL,ddH2O 3.5μL,室温下混匀后,42℃,60min;72℃,15min。PCR总反应体系为25μL,包含反转录产物1μL,ORF3上游引物1μL(10μmol/L),下游引物1μL(10μmol/L),dNTP2μL,Buffer 2.5μL,EXTaq 0.25μL,然后用ddH2O补足至25μL。反应条件:94 ℃预变性4min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸5min。

　　1.5 PCR产物克隆、测序以及ORF3基因遗传进化分析

　　PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后,克隆至pMD18-T载体中,转化后挑取阳性克隆,进行PCR和酶切鉴定,送至上海华大基因科技有限公司进行测序。测定结果与GenBank中登录的65条PEDV的ORF3基因的核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析,用ClustalX 1.8和MEGA 3.1等软件进行遗传进化树分析。

　　2、结果与分析

　　2.1 ORF3基因的序列

　　采自浙江某地猪场的49份样品,经PCR扩增和测序后,41份样品为PEDV阳性,序列经比对后同源性为99.6%~100%。其中的2条序列CH-HZ-11(KC688871)、CH-HZ-11-2(KC81653)已递交至GenBank。

　　2.2 ORF3基因进化树分析

　　2株代表性样品与GenBank中参考序列(表1)构建的系统进化树(图1)表明:PEDV共分成4组(G1、G2、G3、G4及G4的2个亚组G4-1,G4-2)。

　　2011-2012年主要来自广东、广西两省(区)的9条序列与其他省的3条序列组成独立的G1组,欧洲的CV777及兰州的毒株LZC毒株构成G2组,韩国的减毒疫苗株atDR13、欧洲CV777疫苗株与中国CH-GS111-07、SD-M毒株构成G3组,在G4中,韩国的14个毒株(2003-2007年)独立构成G4-1亚组,中国2006-2012年的毒株与4条韩国2007年的毒株构成G4-2亚组,本文所测代表性毒株属于G4-2亚组。

　　2.3 ORF3基因遗传进化分析

　　本研究中扩增的ORF3基因片段长度为774bp,包含完整的ORF3阅读框,675个核苷酸编码224个氨基酸片段。在ATG启动子上游有46个核苷酸的一个基序(CTAGAC)。经DNAStar软件进行核苷酸序列分析后,CH-HZ-11、CH-HZ-11-2两个毒株与经典CV777毒株相比有20个变异位点,其中有8个位点导致氨基酸发生变化;与DR13毒株比较有12个变异位点,其中1个位点导致氨基酸发生变化;与CV777疫苗株相比(除了CV777疫苗株有大片段缺失外)有12个变异位点,与国内前期毒株CH-S相比有12个核苷酸变异位点,但无氨基酸的统一变化。

　　经核苷酸序列分析后,每组的序列都有特异、统一的变化(表2),G1组有9个核苷酸变化,其中208位的核苷酸变化导致氨基酸发生变化(I→V)。G2组有6个核苷酸变化,其中有4处导致氨基酸发生变化(62位A→V,160位V→I,274位F→L,301位T→A)。G3主要是DR13的疫苗株atDR13(EU054930)在245~295处有51个核苷酸的缺失,CH-GSJ111-07、DBI855、SD-M等毒株均在247~295处有49个核苷酸的缺失。

　　G4组中2个亚组在393bp处(除CH-GSJII-07毒株外)有统一的核苷酸变化。G4-1与G4-2亚组相比(除了CH-S毒株外),有2个独特核苷酸的变异(63、237处均是G4-1为C,G4-2为T)。

　　【图1、表1略】

　　G1组毒株和G4-2亚组的一个分支中的毒株同属于2011-2012年,但G1的毒株却自成一组,来源主要以广东、广西地区为主(除AJ1102、CH/HBBD/2001与ZJCZ4外)。

　　G1组与其余3组的遗传变异分析如下:G1组和G2组相比有21个核苷酸差异(表3),其中有9处导致氨基酸的变化(39位V→A,160位V→I,208位I→V,235V→I,274L→F,301A→T,320C→F,497N→S,502D→N)。G1组和G3组相比,有8个核苷酸的差异(G3组除了大片段的核苷酸的缺失外)。

　　G1和G4相比有2个核苷酸的差异,其中238bp处导致氨基酸发生变化V→F。G1和G4-1亚组相比有2个核苷酸的差异,但均没有氨基酸发生变化;与G4-2亚组相比有2个核苷酸的变化,其中502bp处引起氨基酸发生变化D→N,237bp处无氨基酸变化(除了SJZ-2011外)。

　　2.4 ORF3基因的同源性分析

　　对本文的参考序列与代表性毒株序列进行核苷酸和相应氨基酸同源性分析(表4),G1组内所有核苷酸(及氨基酸)序列同源性为98.8% ~99.9%(98.7%~100%),与G2、G3、G4-1、G4-2的核苷酸(及氨基酸)序列同源性分别为94.5% ~96.6%(93.3% ~96.0%)、96.1% ~97.6%(97.1% ~98.6%)、95.6% ~97.6%(96.0% ~98.7%)、95.0%~97.2%(94.7%~98.2%)。G2组内毒株间的同源性为98.5%~100%(98.2%~100%),与G3、G4-1、G4-2的同源性分别为96.3~98.1%(95.7%~97.6%)、95.6% ~98.1%(94.2% ~96.9%)、95.3%~97.5%(93.8%~96.9%)。G3组内核苷酸同源性为99.8%~100%(由于CV777疫苗株、CH/GSJIII/07、SD-M毒株编码的是截短的蛋白,而atDR13(EU054930)编 码的是完整的ORF3阅读框,分析氨基酸序列同源性时只使用at-DR13(EU054930)的序列和其他3组做了分析),与G4-1、G4-2亚组的同源性为97.3% ~98.9%(98.1%~99.5%)、97.0% ~99.0%(98.1% ~99.5%),G4组同源性为96.9%~100%(96.4%~100%),G4-1与G4-2的同源性为96.9%~99.1%(96.9%~100%)。

　　CH-HZ-11与CH-HZ-11-2毒株序列的同源性为99.6%,2株序列与国内前期毒株CH-S的核苷酸(氨基酸)同源性为98.4%~98.5%(99.1%~99.6%),与本文中G1组的同源性为95.6% ~96.7%(96.0%~97.8%)。分析2株序列与韩国经典毒株DR13、欧洲毒株CV777、CV777疫苗株核苷酸(氨基酸 )同源性分别为98.4% ~98.5%(99.1%~99.6%)、96.7% ~96.9%(96.0% ~96.4%)、97.6%~97.8%。

　　3、讨论

　　2006年前,我国猪场使用CV777的弱毒苗或灭活苗预防PED,使得PED处于可防控状态;2006年到2010年间,免疫疫苗的猪场偶尔会暴发PED;2010年后,PED在中国超过10个省区流行,甚至用疫苗免疫的猪场也发病,这引起全国各地兽医学者的急切关注。

　　本研究中,采用RT-PCR方法对浙江某猪场49份样品的PEDV的ORF3基因进行检测,结果有41份样品为阳性,阳性率为80%。测序后,选择2株样品CH-HZ-11、CH-HZ-11-2的序列登录到Gen-Bank中,所测序列包含完整的ORF3基因675bp,编码224个氨基酸。每条序列启动子ATG上游均含有46个核苷酸的基序。文献报道这些基序是亚基因组mRNA转录的起始位点。

　　本文把CH-HZ-11、CH-HZ-11-2毒株序列 同GenBank中所有ORF3的序列进行比对,构建系统进化树,然后剔除100%同源或同一地区高度同源的毒株序列,共67条序列进行遗传进化分析。此次分组地域性明显,共分成4组,主要以华南地区为主的毒株组成G1组;以CV777为代表的欧洲毒株组成G2组;韩国的DR13、欧洲的CV777毒株的疫苗株组成G3组,其中包括中国最近分离的1株SD-M,还有2007年分离的CH-GSJ111-07毒株。

　　G4组分为2个亚组(G4-1,G4-2),G4-1亚组主要以韩国2003-2009年之间的毒株为主。

　　G4-2亚组以中国2006-2012年一些毒株为主,也包含了3株韩国2007年的毒株,其中中国2006-2008年的毒株自成一簇,而2011年到2012年的毒株自成一簇。由此可以看出,ORF3基因除可以区分弱毒的疫苗株和强毒株,还可以区分中国、欧洲与韩国等不同国家的毒株。

　　韩国学者Park等报道通过ORF3基因序列分析,PEDV分成3组(没有包含中国新发的毒株);Pan等报道了CHGD-01毒株的全基因序列,并根据ORF3的氨基酸序列进行了分析,表明CHGD-01毒株为1个单独的分支,并列为单独的一组;Yang等选了15株病毒进行分析,分成3组,从进化树上看,CHGD-01毒株单独1个分支,由于两广地区的毒株就仅此一株,被分在和欧洲毒株CV777为1组。而本文中G1组的CHGD-01和其他两广地区(8株)、河北(1株)、浙江(1株)、湖北(1株)的毒株属于1个独立的分支,与其他3组相比有9个核苷酸的变异。

　　G1组有很明显的地域性,主要由两广地区毒株组成,结合Pan等的报道,证明华南地区PEDV毒株基因发生变异后,远离目前内地流行的毒株(同源性为95.0%~97.2%),成为1个新的基因型。这个结论也得到了全基因序列分析的证实。

　　Wei等分析广东毒株GD-1的全基因序列,表明此株病毒与GD-A和AJ1102归为同一个组,与疫苗毒株CV777和其他国外毒株(包括DR13)关系较远,成为1个新的基因型。施标等对2011-2012年国内新流行的毒株的全基因进行遗传进化分析,结果表明GD-1、GD-A、CHGD-01、AJ1102与ZJCZ4几个流行毒株单独形成1个大的分支,自成1组,表明新近流行毒株已成为1个新的基因型,与国内前期分离毒株亲缘关系较远。

　　本文所测毒株属于G4-2组,2株序列核苷酸与氨基酸同源性均为99.6%,与国内前期毒株CH-S的同源性高于与G1组的同源性,与CH-S相比有12个变异位点,有了一定的变异,与韩国毒株亲缘关系较近。相比较欧洲毒株,所有的中国毒株(G1,G4-2)都和韩国毒株亲缘关系比较近,在剔除100%同源的序列时,中国CH-HNHJ-08、CH-JL-08、CH-SHH-06三个毒株同属G4-2组且和韩国的CPF299毒株100%同源,从进化树分支上看,中国2003-2009年的毒株与韩国毒株更亲近。新近流行的部分毒株与中国2003-2009年流行的毒株属于同一组的不同分支,表明新近流行的毒株与2009年以前流行的毒株相比,有了一定的变异和进化;另外华南地区流行的一些毒株已进化成为1个新的基因型。

　　本结论与PEDVS、M基因的遗传进化分析是一致的。

　　Yang等分析了华中地区的15株PEDV的M基因与ORF3基因,结果这些毒株与2007年后的中国毒株、泰国毒株以及韩国毒株关系密切,且所分析中国毒株分属于不同的亚组,表现出一定的遗传变异。Li等分析了2011年收集的9个毒株的S基因序列,结果有3个毒株包括本文所用CHGD-01毒株自成1支,其他毒株与国内早期毒株归为1组。结合以上S基因及M基因的分析,本文认为2011-2012年国内普遍流行于猪场的PEDV毒株有2个基因型。

　　同一地区同一年代的毒株经过ORF3基因的遗传进化分析后,落入不同的组,如广东毒株GD-B、广西毒株CH-GXWP-2011毒株在G4-2组,而广东毒株GD-A、广西毒株CH-GXWM-2011毒株在G1组,从而说明中国新近流行的PEDV毒株呈现多元化变异和进化,形成基因的多样性。不同地区之间的毒株之间存在差异,同一地区的毒株变异也大到属于不同的组。但是有一些不同分离地的毒株亲缘关系又很相近,有的几乎100%同源。如G1组GD-1与ZJCZ4 100%同源,剔除100%同源序列时,中国黑龙江毒株CH/HLJHG/2011、北京毒株CH/BJYQ/2011与福建毒株CH/FJND-2/2011ORF3基因完全相同,同属于G4-2组。

　　Li等通过M基因分析结果表明,中国华南地区的PEDV毒株与多数的韩国和泰国毒株关系密切,与疫苗毒株 (CV777)关系较远,本文通过ORF3基因分析再次证实目前中国大部分地区流行的毒株已远离CV777疫苗株。从临床上看,本次分离的CH-HZ-11毒株的分离猪场已免疫CV777疫苗,而且很多已免疫疫苗的猪场也没能避免此次PEDV大流行。原因可能是PEDV基因经过多元化变异,导致CV777疫苗已无法达到应有的保护效果。

　　本文对中国新近流行PEDV毒株ORF3基因进行了遗传变异分析,分析表明ORF3基因除可以区分弱毒的疫苗株和强毒株,还可以区分中国、欧洲与韩国等不同国家的毒株,ORF3基因可以作为区分PEDV基因型的遗传标记。

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