固定组织冰冻切片的有效方法

　　冰冻切片是将生物组织置于低温下迅速冻结达到一定硬度后进行切片的一种实验技术，与常规的石蜡切片相比， 它不经脱水、透明、浸蜡等步骤， 因此组织不会收缩， 易保持原有生活形态， 具有快速、简便、易操作等优点，常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究[1,2].由此可知，冰冻切片具有制作迅速，耗时短的优点，但是固定组织在制片过程中经常出现组织脱片，组织肿胀或过度收缩，冰晶形成过多等问题。这些问题将导致实验信息的丢失，使最终得出的结果不准确。因此，本试验以福尔马林固定的猪肺为试验材料进行冰冻切片，通过对载玻片进行防脱片处理，以及将材料浸泡于蔗糖溶液中降低冰晶的产生等方法，探索固定组织冰冻切片的有效方法，为临床病理学诊断提供试验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 试验材料。用中性福尔马林固定猪肺，由延边大学农学院动物医学系病理实验室提供。

　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 载玻片的处理。将新购未经处理的载玻片经1%盐酸浸泡24h,流水冲洗，再经洗涤剂浸泡24h,流水冲洗，烘干，分别经蛋白甘油、多聚赖氨酸、明胶硫酸铬钾处理，
　　
　　1.2.2组织的处理。将取好的组织，分为两组，第一组流水冲洗24h.第二组流水冲洗24h,再浸泡在20%蔗糖24h,30%蔗糖3天。
　　
　　1.2.3切片
　　
　　（1）包埋：从冰冻机中取出包埋托，用水冲洗略去掉表面冰霜，用干纱布擦干，滴加0.3cm 厚包埋剂，然后将取材的组织放在包埋剂上。对于含水分较多的组织先用纱布吸干组织表面水分再进行包埋。包埋后在组织周围进一步补充包埋剂，尽量将组织包在其中[4].
　　
　　（2）时间及温度：将包埋好的组织放入冰冻机的冷冻台上冷冻。根据不同组织将温度控制在-18℃ ~-30℃。严格控制冷冻时间，以刚刚冻上即止为宜。
　　
　　（3）切片及贴片：组织冻好后，进行切片、贴片。切片厚度一般为10 μm,脂肪组织可稍厚些借助载玻片与冰冻。冰冻切片与载玻片存在明显温差，利用这一原理可将二者牢固的贴附在一起。
　　
　　1.2.4 切片的HE染色方法。苏木精染色液是关键的药品，要严格进行配置，配制方法：先把2g苏木精和20ml无水乙醇互溶，然后将40g硫酸铝钾溶于400ml蒸馏水需加热溶解并用玻璃棒不断搅拌，再将以上这两种液体混合后煮大约1min待沸腾，离火后向该混合液快速加入1g氧化汞，并用玻璃棒搅拌至染色液变为紫红色，然后需冷却至室温，加入 16ml冰醋酸并混匀，滤过后使用。乙醇盐酸配制成1%浓度的分化液方法：1ml浓盐酸， 99ml 75%乙醇。0.2%氨水配制方法：25%-28%氨水0.2ml,蒸馏水100ml.HE染色程序：蒸馏水（2min）→苏木精（5min）→水洗（20min）→1%盐酸乙醇分（2s）→蒸馏水（1min）→0.2%氨水返蓝（30s±）→蒸馏水（1min）→伊红（4min）→蒸馏水（1min）→70%乙醇（1min）→80%乙醇（1min）→90%（1min）→95%乙醇（1min）→无水乙醇（1min）→无水乙醇：二甲苯1:1（1min）→二甲苯（I5min）→二甲苯I（I10min）；用树胶封片，进行镜下观察。

　　2 结果

　　2.1 防冰晶作用。经蔗糖浸泡过的组织，切片完整、厚薄均匀、不易形成皱折；镜下组织结构完整，细胞形态清晰，染色鲜艳，胞质与胞核红蓝对比鲜明，细胞无肿胀且无明显收缩，组织无人为裂隙，无空泡及空网状形成，而未经蔗糖浸泡过的组织，切片不完整，组织中有许多空隙，厚薄不一，镜下组织结构不完整。

　　2.2防脱片作用。如表1所示，多聚赖氨酸的脱片数为零，在四个试剂中防脱片效果最佳。其次是明胶硫酸铬钾，脱片数为二，防脱片效果也很优秀。而经蛋白甘油处理过的载玻片和从试剂公司购买的载玻片脱片现象严重。【1】
　　

　　3 讨论

　　冰冻切片是较难掌握的病理技术之一，要制作出一张高质量的冰冻切片，冰冻制片每一步都应严格要求，减少冰冻切片的人工误差，才能更好地应用于临床。据研究学者作切片之前将组织侵泡于蔗糖溶液和对载玻片进行防脱片处理可以极大地提升冰冻切片的质量。将组织置于恒冷箱切片机后，组织中的水分子就会逐渐凝固，最终产生冰晶，而冰晶的体积大于水分子，因此会占据更多空间，使得周围细胞器的空间被压缩，当操作员将冰冻切片从切片机中移到室温环境时，由于温度的升高，冰晶又融化回水分子，体积减小造成组织上空隙的形成，使组织碎片化，严重影响后续的步骤。水在-4℃时体积达到最大值，这意味着组织在-4℃左右的低温度中放置时间越久，组织内所产生的冰晶的体积越大、数量越多，即组织冷冻的速度与组织内形成冰晶的数量成反比。因此，要尽量避免冷却速度缓慢的情况，应使组织所处环境的温度迅速降至-4℃以下；或者将组织进行脱水处理来减少冰晶的形成。OCT胶是最佳切片温度溶液，是一种多糖类物质，它既可以对支架起到包埋作用，又可以对组织进行脱水，但它的脱水效果远不及蔗糖溶液明显[3].本试验结果表明，蔗糖处理，可有效提高切片的质量，减少冰晶的产生。脱片是指组织从载玻片上脱落，分离或悬浮但尚未脱下。
　　
　　载玻片的处理及工作人员对切片制作的熟练度等都能影响冰冻切片的脱片情况，固定组织冰冻切片很容易脱片，给后续染色等过程带来了很大麻烦与不便，这些因素会使冰冻切片在染色过程中脱片程度不一，切片可能是边缘部轻度卷曲，也可能是不同面积的脱落或完全脱片。如何处理载玻片是防脱片的关键步骤，据报道防脱片剂有多种类型，如蛋白甘油，多聚赖氨酸，明胶硫酸铬钾。其中多聚赖氨酸溶液配制方便，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用产生较强的粘附力，粘附效果显着。可用于组织切片，细胞切片，冰冻切片等，能切实有效的降低脱片现象[4].本试验结果表明，多聚赖氨酸的脱片数为零，在四个试剂中防脱片效果最佳。其次是明胶硫酸铬钾，脱片数为二，防脱片效果也很优秀。而经蛋白甘油处理过的载玻片和从试剂公司购买的载玻片脱片现象严重。总之，冰冻切片不易掌握，要做好一张冰冻切片不能只注重速度，其他方面也很重要。为了不误诊，漏诊，确保结果的准确迅速，需要工作人员在进行冰冻切片时有严格的责任心，密切联系临床，严谨的工作态度，丰富的工作实践经验，不断总结自己过往的经验，从而不断的提升自己的技术水平。

　　参考文献
　　
　　[1]刘成龙，余琦，周会芹。7 种固定液对冷冻组织切片固定效果的比较[J].诊断病理学杂志，2010,2:138.
　　[2]杨秀静，滕孝静。冰冻切片技术经验探讨[J].临床和实验医学杂，2014,23:2002-2004.
　　[3]周喜凤。制作优质冰冻切片的体会[J].基层医学论坛，2015,11:1527.
　　[4]许平，王筱璨，陈奎生。快速冰冻切片制备方法的改进[J].郑州大学学报（医学版），2010,2:241-243.