纳米氧化镍（nickel oxide,Ni O） 是一种重要的功能材料，由于尺寸与形貌的独特性，其在涂饰、催化、电容电极、光吸收、气敏传感等工业领域广泛应用。同时，纳米Ni O也大量存在于工业生产过程和焊接烟雾中，经呼吸道吸入是其进入人体的主要方式，其吸入毒性已成为近期研究热点之一[1].研究发现，纳米Ni O的细胞毒性与伴随的氧化应激和硝化应激（nitrative stress） 有关[2].体外和体内实验研究显示，纳米Ni O可导致机体肺组织炎症反应[3],且与微米颗粒相比纳米颗粒毒性反应更强[4].目前纳米Ni O的肺毒性效应及机制尚不明确。本文旨在观察纳米Ni O对大鼠的亚慢性肺损伤并从硝化应激的角度初步探讨其可能机制。
1 材料与方法
1. 1材料
1. 1. 1实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠40只，体重200 ~ 240 g,购自兰州大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（ 甘）2013-0002.
1. 1. 2仪器和试剂CP750超声波破碎仪（ 美国Cole-Parmer仪器公司） ,BX53F双目生物显微镜（ 日本Olympus公司） ,Eon全功能多波段酶标仪（ 美国伯腾仪器有限公司）。总蛋白定量测定试剂盒（BCA法） 和一氧化氮（nitric oxide,NO）、总一氧化氮合酶（total nitric oxide synthase,TNOS）、诱 导 型 一 氧 化 氮 合 酶 （inducible nitric oxidesynthase,i NOS） 试剂盒 （ 南京建成生物工程研究所）。大鼠白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）、转化生 长 因 子-β（transforming growth factor-beta,TGF-β）、干扰素-γ（interferon-gamma,IFN-γ） 和8-羟基 脱 氧 鸟 苷 （8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHd G）ELISA试剂盒（ 上海晶天生物科技有限公司）。纳米、微米Ni O购自上海水田材料科技有限公司，相关表征参数见表1.
1. 2方法
1. 2. 1染毒样品的制备 纳米、微米Ni O颗粒和生理盐水溶液于120℃、30 min条件下灭菌后，分别配制成纳米Ni O 0. 015、0. 06、0. 24 mg /m L和微米Ni O 0. 24 mg /m L的混悬液，气管滴注前冰水浴中超声处理15 min,旋涡混合器机械振荡5 min.
1. 2. 2动物分组与染毒40只雄性Wistar大鼠染毒前适应环境5 d,随机分为5组： 生理盐水对照组，纳米Ni O 0. 015、0. 06、0. 24 mg /kg组和微米Ni O 0. 24 mg /kg组，每组8只。大鼠乙醚麻醉后行非暴露式气管滴注，按1 m L/kg染毒，每周2次，连续6周。大鼠染毒结束后乙醚麻醉，心脏采血后处死，收集肺组织，- 80℃低温冻存备用。
1. 2. 3肺组织病理学检测 大鼠处死后，解剖摘取右肺后叶，4%多聚甲醛固定，常规制备病理切片，HE染色后光镜下观察大鼠肺组织病理学变化。
1. 2. 4肺组织匀浆制备与硝化应激指标检测取低温冻存的大鼠左肺，称重，按照1∶ 9（m/V） 的比例加入冰冷的生理盐水，用玻璃匀浆器在冰水浴（0 ~ 4℃） 中制成10%肺组织匀浆，4℃、3000 r/min离心10 min,取上清液备用。严格按照试剂盒操作说明，于酶标仪562 nm波长处测定肺组织匀浆中蛋白含量，550 nm波长处检测NO含量，530 nm波长处测定TNOS和i NOS的活性。
1. 2. 5血样采集与指标检测 大鼠乙醚麻醉后心脏采血，血样置冰箱冷藏15 min后于4℃、1000r / min离心10 min,取血清备用。严格按照ELISA试剂盒操作说明，于酶标仪450 nm波长处测定大鼠血清中IL-2、TGF-β、IFN-γ及8-OHd G的含量。
1. 3统计学分析
数据用x珋± s表示，采用SPSS 20. 0统计软件对其进行单因素方差分析，并行组间比较。检验水准为0. 05,P < 0. 05为差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1肺组织HE染色观察结果
如图1所示，对照组肺泡扩张良好，肺泡腔及肺泡间隔内未见沉积物，未发现明显病理改变。大鼠气管滴注纳米Ni O后，可见肺组织出现不同程度的炎性细胞浸润、肺泡间隔增宽和颗粒物沉积现象，主要以0. 06和0. 24 mg /kg纳米Ni O组为主，且相同剂量的纳米Ni O组上述变化较微米Ni O组严重。
2. 2纳米Ni O染毒后肺组织硝化应激指标的变化
如表2所示，纳米Ni O 0. 24 mg /kg组NO含量、TNOS和i NOS活性均升高，与对照组比较差异均具有统计学意义（P < 0. 05）。与微米组相比，纳米Ni O 0. 24 mg /kg组NO含量和i NOS活性也升高，差异亦具有统计学意义（P < 0. 05）。
2. 3纳米Ni O对大鼠血清部分细胞因子和8-OHd G含量的影响
如表3所示，与对照组相比，纳米Ni O 0. 06和0. 24 mg /kg组血清IL-2含量升高，纳米Ni O各剂量组血清TGF-β和IFN-γ含量均升高，纳米Ni O 0. 24 mg / kg组血清8-OHd G含量升高，差异均具有统计学意义（P < 0. 05）。与微米组比较，纳米Ni O 0. 24 mg /kg组血清IL-2和8-OHd G含量升高，差异具有统计学意义（P < 0. 05）。
3 讨论
纳米材料职业人群主要以男性职工为主，因此本研究选择雄性Wistar大鼠为研究对象。参考MIZUGUCHI课题组的纳米Ni O染毒剂量[4],本研究通过气管滴注方式构建纳米Ni O肺损伤模型。纳米物质的毒性大小与其理化特性密切相关。CHO等[5]分别给大鼠气管滴注等比表面积剂量的不同纳米颗粒，结果发现其中4种（ 纳米Ce O2、纳米Ni O、纳米Zn O、纳米Cu O） 可明显引起大鼠肺部炎症且不同纳米材料所致炎症在时长、炎性细胞和介质种类及细胞毒性等方面均有不同的表现。本研究组织病理学结果显示，相比对照组，纳米Ni O各剂量组均出现不同程度的病理改变，剂量越高，损伤越严重，尤其以纳米Ni O 0. 24mg / kg组为重。同时发现相同染毒剂量下，纳米Ni O比微米Ni O引起的组织损伤更严重，这也与OGAMI等[6]的研究结果一致，说明组织损伤的程度与颗粒粒径有关。
氧化应激与硝化应激常伴随发生，参与多种疾病的发生发展过程[7].硝化应激与一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS） 的异常表达有密切联系。i NOS在生理状态下表达很少，主要在炎症刺激下诱导合成，为钙离子非依赖型NOS[8].在肺组织中i NOS可在多种细胞中诱导表达，包括活化的巨噬细胞和肺泡上皮细胞等[9].体内过量NO生成可致组织损伤，一方面其本身具有细胞毒性和促炎作用，另一方面NO与O2-迅速反应生成的ONOO-可进一步造成病理损伤[10].本文结果发现纳米Ni O 0. 24 mg /kg组肺组织匀浆中TNOS和i NOS的活力均高于对照组，其中i NOS活力与微米组相比也升高，提示纳米Ni O经气道到达肺部后，引起肺部炎症，激活肺泡巨噬细胞，诱导其合成i NOS,继而产生大量NO,引起硝化应激反应，从而导致肺组织损伤。研究表明，NO还参与肺纤维化的形成过程，抑制NO的生成可以减轻肺纤维化的程度[11].TGF-β作为致纤维化的关键因子，在肺纤维化过程中有重要作用[12].本文结果发现纳米Ni O染毒大鼠血清TGF-β水平升高，提示纳米Ni O可能引起大鼠肺组织一定程度的纤维化，这可能与NO生成增多有关，但尚需进一步研究证实。
纳米颗粒因其尺寸极小，可能躲避巨噬细胞的吞噬作用而与血清蛋白结合成为半抗原，引起一系列免疫级联反应，并可能导致组织损伤[13].CHANG等[14]对纳米二氧化钛（titanium dioxide,Ti O2） 的肺毒性研究表明，肺脏对纳米Ti O2的刺激先表现为非特异性免疫反应，随后转变为持久的特异性免疫反应。IL-2是体内重要的免疫调控因子，主要由CD4+和CD8+T细胞在抗原刺激下以旁分泌或自分泌的形式释放，能促进Th1细胞分泌IFN-γ[15].本文结果显示，纳米Ni O 0. 06和0. 24 mg / kg组大鼠血清中IL-2含量高于对照组，可能是机体对外来纳米Ni O颗粒做出的免疫应答反应，从而活化免疫细胞而间接引起肺组织损伤。纳米Ni O染毒大鼠血清IFN-γ含量增多，这可能与IL-2合成增多有关。IFN-γ作为i NOS的诱导剂，能诱导巨噬细胞合成i NOS,故IFN-γ水平升高进一步促进NO的产生而加重硝化应激反应。
氧化应 激时机体 产生 大 量 活 性 氧 自 由 基（reactive oxygen species,ROS） ,攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基生成8-OHd G,故8-OHd G是DNA氧化损伤的重要标志物[16].本研究结果显示，纳米Ni O染毒大鼠血清8-OHd G含量与对照组和微米组相比均明显升高，说明纳米Ni O可能通过诱导机体ROS的产生从而造成DNA氧化损伤。
综上所述，气管滴注一定浓度的纳米Ni O可引起大鼠肺损伤，可能与其诱导肺组织i NOS和NO水平升高有关，其机制还有待于进一步探索。
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