中枢神经系统的动物行为学检测方法

　　动物行为学论文（无删减范文8篇）之第五篇

　　摘要：动物行为学检测方法是利用动物觅食、求生、逃避伤害以及喜暗等本能行为和善于学习的特性来观察动物的情绪和学习记忆, 从而反映动物中枢神经系统功能变化的实验方法。本文将从实验原理、仪器组成、测试方法以及评价指标等方面对中枢神经系统相关的动物行为学检测方法进行简要综述。

　　关键词：动物行为学,中枢神经系统

　　动物行为学研究内容包括动物领域行为、沟通行为、觅食行为、繁殖行为以及学习行为等, 动物通过先天本能和后天学习来适应环境变化。利用上述特性设计实验来观察动物的情绪变化、认知功能改变及其影响因素, 有助于了解中枢神经系统的作用机制和功能变化, 并且动物行为学与神经科学和心理学等生命科学的多个分支学科相互交叉渗透, 从不同角度系统阐释动物行为的产生原因及其机制。本文针对常用的几种中枢神经系统动物行为学检测方法作一简要综述。

　　1迷宫检测方法

　　1.1 Morris水迷宫

　　Morris水迷宫是首选的研究动物空间学习与记忆能力的经典实验, 广泛应用于药物研发、心理学、神经科学和毒理学等多个领域的研究。其原理是利用啮齿类动物天性怕水而又善于游泳的特性, 连续训练多日后, 使其学会找到水池内位于水下的逃逸平台, 从而进行相关的中枢神经系统功能研究。

　　Morris水迷宫由一个圆形水池 (直径120cm, 高度50cm) 和一个逃逸平台 (直径10cm, 高度22cm) 组成。水池分为四个象限, 位于水面上方的四个象限中间区域桶壁上分别贴有正方形、圆形、三角形和菱形作为参照图案, 任选其中一个象限正中放置逃逸平台, 水位控制在逃逸平台上方1-2cm处, 水内撒入奶粉或墨汁混匀直至动物看不到逃逸平台为止, 实验期间水温均保持在24±2℃[1], 保持参考图案位置、顺序及室内光线强度等不变。实验开始前用苦味酸标记动物头部, 选择冷暖色调分析或灰度值分析以便系统跟踪其运动轨迹。实验正式开始后, 实验者应远离水池, 使动物看不见实验者, 以防止动物将实验者视为参考物。图像采集由水面正上方的数字摄像头全自动跟踪记录, 实验结果分析由系统自动统计处理完成。Morris水迷宫实验由定位航行实验 (也称为隐藏平台实验) 和空间探索实验两部分组成。

　　在正式实验前进行适应性训练一天, 把动物面朝池壁放入水中, 待其自由游泳2min后取出, 擦干水分收入笼中。定位航行实验于每天上午进行, 持续6d。每只动物测试4次, 单次测试时间为1-2min。动物第一次入水象限为逃逸平台所在象限的对面象限, 其他3次由不同象限随机入水 (除逃逸平台所在象限外) , 入水点在每个象限池壁1/2中点处。动物入水后开始计时, 从入水到找到逃逸平台的时间即为逃避潜伏期, 动物找到逃逸平台后允许其在平台上停留10-20s, 未在规定的1-2min之内找到逃逸平台的动物, 逃避潜伏期记为2min, 实验人员帮助动物找到平台, 并使其停留10-20s, 若动物在平台停留阶段掉落水中则重新计时。实验结束后将动物从平台取下, 休息30s后进行下一次实验。取2-4次测试成绩的平均值作为每天每只动物的测试成绩[2,3]。主要的评价指标包括逃避潜伏期、游泳轨迹、游泳速度、总运动距离以及搜索策略, 用以评价动物的学习记忆能力[4]。

　　空间探索实验用于测定动物的空间记忆能力, 定位航行实验结束后24-48h内, 撤去逃逸平台, 开始空间探索实验, 动物的入水点在原平台象限的对面象限[5]。动物在水池内自由游泳1-2min, 记录动物在目标象限 (原平台所在象限) 的滞留时间以及进入这个象限的次数。选择动物原平台象限滞留时间百分比、经过平台次数、第一次经过平台时间、有效区域运动时间及进入次数、游泳总路程以及游泳平均速度等作为评价指标, 用来评价动物空间记忆能力的保持情况[4]。此外, 可根据实验需要改进实验方案, 例如间歇出现平台或放置双平台, 能够提高对动物空间学习和记忆能力测量的敏感性。

　　1.2八臂迷宫

　　八臂迷宫的实验原理是在动物饥饿状态下, 连续训练多日, 其可凭记忆快速选择出正确放置食物的臂从而获得食物, 广泛用于检测给药或研究动物学习记忆功能的变化情况。

　　八臂迷宫的实验装置由中央平台和八条放射状臂 (长425mm×宽100mm×高225mm) 组成[6], 每条臂末端有喂食槽 (直径25mm, 深度18mm) 。正式实验前两天进行适应性训练, 放置若干食物在中央平台区及各臂, 在八臂迷宫中央平台区同时放入3-4只动物, 允许它们自由活动和摄食, 时间为10min, 每天上下午各一次, 持续2d, 以适应迷宫内部环境。动物在实验开始前24h禁食, 之后每日限制性给食, 自由摄水, 使其体重在实验期间保持在原体重的85%左右。实验共历时6 d, 每天上午进行测试, 每只动物测试一次, 单次测试时间为10min, 在八条臂中随机选取四条臂作为投食臂, 在喂食槽内放置食物且实验期间投食臂位置均保持不变, 实验期间室内光线强度以及参考物也均保持不变。实验者将动物放置于中央平台区, 用透明罩罩住动物, 10s后将透明罩取走, 动物任意选择方向, 同时开始计时直至动物吃完四条臂内的食物或10min后将动物取出, 动物在实验中再次进入已经吃过食物的臂的次数为工作记忆错误, 进入未放置食物的臂的次数为参考记忆错误[7]。

　　实验利用迷宫中央区上方的数字摄像头全自动跟踪记录, 可选取潜伏期、工作记忆错误、参考记忆错误、总入臂次数、正确率以及轨迹图等作为学习记忆的评价指标。

　　1.3高架十字迷宫

　　高架十字迷宫是利用动物对陌生环境的探索欲和对高悬开臂的恐惧形成探索和回避的矛盾冲突行为, 用来评价啮齿类动物焦虑状态的实验方法。当动物从位置较高的开臂俯视时, 会产生恐惧不安的心理, 另外, 啮齿类动物的嗜暗性使其倾向于在黑暗的闭臂中活动, 但对新奇陌生环境的好奇又促使其在开臂中活动, 这就产生了矛盾冲突行为, 从而导致了动物的焦虑[8], 比较动物在开臂和闭臂内的滞留时间和路程可以评价动物的焦虑行为[9]。

　　高架十字迷宫由开放和封闭的两条十字形交叉臂组成, 距离地面有一定的高度。开臂和闭臂的长度均为50cm, 宽度均为10cm。交叉部分也称为中央区, 为长10cm×宽10cm的中平台区。为避免应激对实验的影响, 动物应提前适应周围环境3h左右, 以缓解其紧张情绪。实验开始后, 将动物面朝开臂放于迷宫中央区, 实验者迅速远离迷宫装置, 利用视频记录系统记录动物的活动, 时间为5min, 每只动物只检测一次。实验结束后, 迷宫装置需用75%乙醇擦拭, 以消除残留的动物气味, 以免影响其他动物的实验结果[10]。

　　图像采集由数字摄像头全自动跟踪记录, 实验数据结果分析由系统自动统计处理完成。选取动物进入开臂和闭臂次数、两臂运动距离、总入臂次数以及滞留时间等作为评价指标。

　　1.4开场实验

　　与高架十字迷宫实验原理相类似, 开场实验是利用动物在开放敞箱内倾向于呆在角落或靠边行走, 但喜爱探索新奇环境的天性使其倾向于在中央区活动, 因此导致矛盾冲突行为的产生。开场实验可用以检测动物的焦虑程度和自主活动能力[11], 评价药物抗焦虑和致焦虑作用, 广泛应用于药理学、生理学和神经生物学等研究领域。

　　开场实验装置是大小为长60cm×宽60cm×高60cm的顶部开口的箱体, 内面箱底均分为25个方格, 位于箱壁一圈的方格称为外周格, 内部方格称为中央格。在箱体一侧面外设有反光镜, 用以记录动物的站立次数。实验时, 将动物放在实验装置中央区, 利用自动视频监控系统记录5-15min内动物的自主活动情况, 动物完成实验后用75%乙醇擦拭实验装置, 去除气味, 以免对其他动物造成影响[12]。

　　开场实验的主要评价指标包括穿越格子数、中央格运动距离、停留时间、站立次数、梳理毛发次数以及粪便颗粒数等。动物的穿越格子数和站立次数可以反映其自主活动能力, 动物的中央格运动距离、停留时间、梳理毛发次数以及粪便颗粒数等能够反映其焦虑情绪[13]。

　　1.5 T型迷宫

　　T型迷宫广泛应用于研究不同脑区对工作记忆、条件识别学习以及交替行为等的影响, 与药物研制或毒理学研究密切相关。与八臂迷宫实验原理相似, T型迷宫利用食物诱导, 从而对动物学习记忆及空间定位能力进行分析。

　　T型迷宫由两条目标臂 (长46cm×宽10cm×高10cm) 和一条垂直于两条目标臂的起始臂 (长71cm×宽10cm×高10cm) 组成, 目标臂末端设有食物槽, 起始臂末端有个起始箱, 起始箱和起始臂之间由一隔板相隔离。实验前限制动物饮食以使其体重保持在原体重的85%左右。实验适应阶段让动物熟悉迷宫并学会跑到左右目标臂尽头来获取食物, 允许每只动物在迷宫中滞留20-30min。实验正式开始后, 每只动物进行10回实验, 每回包括强制次和选择次各一次, 时间间隔60s。强制次为随机选取左右方向各五次, 按选好的方向将隔板放在非目标方向侧, 阻止动物进入非目标方向臂, 在食物槽内放置一粒食物, 待动物进入目标臂吃完食物后将其放回笼内。30s后开始选择次实验, 将隔板移开, 两条臂均开放, 将鼠放至起始臂, 动物将四肢置于目标臂内定为一次选择, 观察记录动物所选择的臂, 如选择方向与强制次方向相同, 则给一粒食物作为奖励, 若不同则无奖励, 并让其在该臂滞留10s, 记为一次工作记忆错误[14]。

　　图像采集由数字摄像头全自动跟踪记录, 实验结果分析由系统自动统计处理完成。T型迷宫主要评价指标是动物工作记忆错误次数和完成实验所需的时间。

　　1.6 Y型迷宫

　　Y型迷宫主要用于测试动物空间辨别型学习记忆和逃避条件反射能力[15], 在研究老年痴呆发病机理和药物研发方面有着广泛的应用, 实验原理是啮齿类动物天性喜爱阴暗的角落, 给予电刺激促使其远离阴暗区, 逃往有灯光照射的安全区。实验中动物利用自身所处空间位置与外界参考物从而获得辨别方位的能力[16]。训练后, 当灯亮起时, 动物将逃往安全区从而躲避电击。

　　Y型迷宫是一个长50cm×宽10cm×高30cm的三等臂相接装置, 臂间夹角均为120?[17], 底部为可通电金属棒, 每臂末端有信号灯, 灯亮时表示该臂未通电为安全区域, 另外两臂为通电状态, 电压一般控制在50-70V之间, 选取能使动物逃避而又未导致应激状态的电压值, 淘汰对电刺激过于敏感和不敏感的动物[18]。每只动物在装置内适应3min后正式开始实验, 电击延时为5s, 随机变换安全区域, 动物立即逃到安全区为正确反应, 下次测试起步区为上一次安全区所在臂, 连续20次实验中至少18次正确即为学会。运用同样方法, 在学会24h后再次进行实验, 以测试动物记忆的保持情况。每只动物完成一次实验后用75%乙醇擦拭实验装置, 去除气味以免对其他动物造成影响。

　　视频分析系统可实时录像并自动统计实验数据。实验主要评价指标为动物学会所需训练天数和次数, 以及正确反应次数比率[19]。动物学会所需训练天数及次数越少, 证明动物的学习能力越强, 学会24h后再次测试时, 正确反应次数比率越高说明动物记忆保持能力越强。

　　1.7 Barnes迷宫

　　Barnes迷宫主要用于检测动物对目标的空间记忆能力, 广泛应用于与应激相关的记忆研究以及基因敲除小鼠的行为表型研究中。与高架十字迷宫和八臂迷宫相类似, Barnes迷宫同样是利用啮齿类动物喜爱黑暗角落且探索欲强的特性设计而成。

　　Barnes迷宫实验装置是一个可旋转的圆形平台 (直径122cm, 高度140cm) , 其周边有18个或40个等距离小圆洞, 小圆洞直径为10cm或5cm, 选择一个洞作为目标洞, 在其底部放置一暗箱供动物隐藏[20]。实验前一天进行适应性训练, 将单只动物由目标洞放至暗箱, 停留4min, 使其熟悉实验装置。实验开始时, 先将动物放至圆形平台中央处, 用透明罩罩住动物5s, 打开透明罩使其自由选择方向, 并开始计时, 动物四肢均位于暗箱内时, 允许其在暗箱内停留30-120s, 记为一次正确选择, 如在4min内未找到暗箱, 实验者将其放入暗箱并停留30-120s, 实验历时5-6d[21]。为防止动物气味追踪找到暗箱, 每只动物实验结束后, 用75%乙醇擦拭平台并随机旋转迷宫 (暗箱所处空间位置始终保持不变) , 以免气味对其他动物造成影响。

　　图像采集由数字摄像头全自动跟踪记录, 实验结果分析由系统自动统计处理完成。Barnes迷宫利用动物找到目标洞的潜伏期、进入错误洞口次数以及总探索次数和轨迹图等作为主要的评价指标, 来反映动物的空间记忆能力。

　　2穿梭箱

　　穿梭箱是常用来评价动物学习记忆和行为改变的一种实验方法。通过声音 (光) 和电击刺激动物, 使其学会逃避, 形成条件反射, 进而评估动物学习记忆能力的改变[22]。

　　实验装置为一长50cm×宽16cm×高18cm的箱子, 箱底部为可通电金属栅, 箱底中央部分有一隔板将箱子分成左右两部分。实验开始前一天的适应性训练时间为10min, 允许动物在箱内自由活动。正式开始实验时, 动物在箱内适应5min后, 被放置于电击区, 10s蜂鸣音后给予10s电刺激 (电流强度30V, 50HZ) , 如蜂鸣音响起时, 动物逃往安全区, 记为主动回避反应, 被电击10s内未移动位置或逃往安全区, 记为被动回避反应。实验共历时10d, 每天训练30-50次[23]。

　　通过计算机视频控制系统和自动分析软件处理实验结果, 可选取主动回避反应次数及时间、被动回避反应次数以及主动回避率等作为评价指标。

　　3跳台实验

　　将啮齿类动物置于跳台实验反应箱内, 由于天性使其更偏爱探索箱体边缘海外角落位置。与穿梭箱实验原理类似, 跳台实验是以电击为刺激促使动物被动回避从而建立条件反射的一种行为学检测方法, 主要用于中枢神经系统药物干预效果的评价。跳台实验装置由方形反应箱和位于其中心的高站台组成, 箱底部安有铜栅可以通电。在反应箱内动物会为了逃避电击而主动跳上站台, 若动物跳下站台将会再次受到电击, 促使其再次跳回站台。动物在正式实验开始前进入反应箱内适应3-5min。实验时, 动物受到稳定电压电击后[24], 立即跳至平台上, 实验时间为5min, 若动物在5min内未能跳上平台则淘汰该动物。24h后再次测试, 实验时间3-5min。

　　图像采集由数字摄像头全自动跟踪记录, 实验结果分析由系统自动统计处理完成。选择错误跳下平台次数作为动物的学习评价指标, 选取动物24h后再测试实验中第一次跳下平台的时间和次数来评价动物记忆的保持能力。

　　行为学检测方法能够直接准确地反映出动物中枢神经系统功能的变化情况, 然而实验动物的种属、性别、实验间隔、粪便、气味以及实验时间段等均可能会影响动物的行为方式, 进而影响实验结果。因此, 如何根据实验需要选择恰当的动物行为学检测方法就显得尤为重要。

　　参考文献
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