比较两种酵母对奶牛瘤胃体外发酵特性的影响

　　由于畜禽生产中抗生素的滥用及其残留对动物和人类健康构成了严重隐患，欧盟已经立法全面禁止抗生素在畜禽生产中的使用，我国及其他国家也已陆续出台相关法律法规限制在畜禽生产中使用抗生素。因此，作为抗生素的替代产品，饲用微生物（Direct-fed Microorganism, DFM），又称益生素（Probiotics），正日益成为一种新型的饲料添加剂得到了较为充分的研究与应用，酵母菌更是作为热点之一激发了动物营养学家们的广泛研究兴趣。然而，大部分关于酵母菌的研究都集中在酵母培养物方面，而关于活性酵母的研究则相对较少。已有的关于活性酵母的研究结果证明，添加活性酵母对反刍动物的瘤胃发酵、生产性能、产品质量及其安全性等方面都有积极的影响。然而不同的试验所得的结果却不尽相同，这是由于酵母菌的益生作用与试验动物的种类、日粮类型、饲喂管理方式等密切相关，如在育肥期内肉牛日粮中添加酿酒酵母可使其体重增加 7.5%。另有研究发现，添加酿酒酵母时，饲喂青贮料比饲喂高纤维的农副产品和高比例的大麦效果更好。另外酵母的添加作用也会因酵母菌菌种的结构及生物活性的不同而产生差异。Newbold 等的体外发酵试验结果显示，添加 NCYC240 与 NCYC1026 两种酿酒酵母菌株能够增加瘤胃中细菌总数及纤维降解菌的数量。

　　已经证实，在奶牛日粮中添加酵母产品能起到如下作用：

　　提高营养物质消化率、调整瘤胃中挥发性脂肪酸（VFA）的浓度与比例、减少瘤胃中氨的浓度、增加瘤胃内微生物种群数量等，但是其作用机制尚未得到完整的研究和解释。活性酵母被证实可以通过稳定瘤胃 pH 以改善瘤胃发酵条件，也有研究表明高温条件下在日粮中添加活性酵母可以改善瘤胃环境，提高干物质采食量、饲料报酬和生产性能。由于活性酵母菌通常需要利用氧气以代谢糖类或其它营养物质，有研究者推测活性酵母菌可以通过消耗氧气而平衡瘤胃中的氧化还原反应，从而为瘤胃内的微生物群落创造严格厌氧的最佳发酵环境。

　　本试验的目的即运用瘤胃体外发酵技术，初步探究并比较两种酵母对奶牛瘤胃体外发酵特性的影响，从而预测活性酵母对奶牛生产性能可能的影响，以期为研究酵母在反刍动物生产中的实际应用与营养生理调控提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　1.1.1 发酵底物 2 种待发酵粗饲料底物分别为玉米秸秆（湖南长沙科湘甜玉 1 号）与水稻秸秆（湖南浏阳湘 125s）。底物经 65℃烘干 24h，经 1mm 孔径筛粉碎后备用。按照杨胜等确定的常规方法测定其干物质（DM）、有机物（OM）、粗蛋白（CP）以及粗脂肪（EE）等含量；依照 Hall 等的方法进行调整，使用 Fibretherm FT12 全自动纤维仪（Gerhardt AnalyticalSystems, Germany）测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量。具体成分含量见表 1。【表1】

　　
　　1.1.2 酵母来源 本试验所用的两种酵母分别为法国乐斯福集团（Lesaffre Feed Additives, France）及中国安琪公司（AngelYeast Co., Ltd, P.R. China）所生产的商业活性酵母产品，菌种均为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），活菌数浓度分别为1.5×1010cfu/g 和 2.0×1010cfu/g。

　　1.2 试验动物、日粮及饲养管理

　　1.2.1 瘤胃液供给动物 选择 3 头体况良好、年龄相同（3 胎次）、体重相近（500±50kg）的荷斯坦奶牛，安装永久瘤胃瘘管后，护理 20d，瘤胃瘘管安装适应期为 1 个月。

　　1.2.2 试验动物日粮及饲养管理 试验日粮参照 NRC 泌乳奶牛饲养标准配制。基础日粮由水稻秸秆和精料补充料组成，日粮精粗比为 40∶60。日粮组成及营养成分如表 2 所示。【表2】

　　1.3 体外发酵试验设计及方法

　　两种活性酵母产品均设置 4 个添加水平，采取单因子区组试验设计，在 39℃恒温培养箱中培养 48h。两种酵母的不同添加水平作为一个处理，每个处理设置 12h、24h、48h 三个采样时间点重复，每个采样时间点再设置 3 个样品重复。表 3为本试验活性酵母的添加方案。【表3】

　　
　　1.3.1 体外发酵培养液的配制及预处理 按照 Menke 与Steingass的方法于体外发酵前一天配制瘤胃体外发酵厌氧缓冲液。在晨饲前通过瘘管采集奶牛瘤胃液，用四层纱布过滤后与厌氧缓冲液以 1∶9 的比例充分混合成发酵培养液。混合好的培养液在发酵前迅速通入 CO22-3min 后，置于39℃的水浴摇床上等待培养。

　　1.3.2 发酵准备及培养 于体外发酵前 24h 预先在各厌氧发酵瓶中称取 0.5±0.0003 g 底物，在 39℃恒温培养箱中放置过夜。并于体外发酵前 24h 预先将活性干酵母粉用蒸馏水配制成溶液。次日向发酵瓶中持续通入 CO22min，随即先后加入已配制好的不同梯度的酵母溶液和 50 ml 体外发酵培养液，并再次持续通入 CO23min，加上瓶塞后迅速使用针头放气将气压调节成 0，此即 0 h 点的气压值。随后立即放置于39℃恒温培养箱中开始体外发酵 48h。

　　1.3.3 实验数据计算及样品采集分析
　　（1）体外发酵总产气量。分别于体外发酵中的 0 h、1 h、2h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h 使用压力传感器（CYG130-12，昆山双桥传感器测控技术有限公司） 测定发酵瓶内的气压，并将气压换算成为室温标准气压下的气体体积，换算公式为：y=1.506x其中 1.506 为实测压强与体积之间的换算系数，x 为压强，y 为产气量。

　　将各时间点测得总产气量运用 LE 体外发酵产气模型进行拟合，计算动态发酵产气参数。模型公式如下：【1】

　　
　　上式中 y 表示 t 时间点底物的产气量（ml）；vf 表示理论最大产气量（ml）；k 表示产气分率；b 和 d 是曲线的形状指标，b>0 表示曲线为 s 形，b<0 则表示曲线非 s 形。另有计算公式：【2】

　　
　　FRD0表示发酵初期气体产生速率；t0.5表示达到最大产气量一半所需的发酵时间。

　　（2）体外发酵干物质消失率（DMD）。分别于体外发酵中的 12 h、24 h、48 h 取出发酵瓶，发酵液过 400 目尼龙布后将残渣全部转移至石英坩埚中用热蒸馏水反复冲洗，随后置于105℃烘箱中烘干 8 h 以测定干物质消失率。测定过干物质消失率后的残渣回收用样品袋密封保存，以备DM消失率的测定。DMD=[1-(m/M)]×100%式中 m 表示发酵后底物干物质质量；M 表示发酵前底物干物质质量。

　　（3）体外发酵中性洗涤纤维消失率（NDFD）。NDF 的测定方法参照 Hall 等的方法，使用 Fibretherm FT12 全自动纤维仪（Gerhardt Analytical Systems, Germany）进行测定。NDFD=[1-(m2/m1)]×100%式中 m1表示发酵前底物中含有的 NDF 质量，m2表示发酵后底物中剩余的 NDF 质量。

　　（4）体外发酵液 pH 值。分别于体外发酵中的 12 h、24 h、48 h 取出发酵瓶，每瓶取出 2ml 发酵液立即用 pH 计（REXPHS-3C，上海仪器设备厂）测定其 pH 值。

　　（5）体外发酵液 NH3-N 浓度。分别于体外发酵中的 12 h、24 h、48 h 取出发酵瓶，每瓶取出 2 ml 发酵液用于 NH3-N 浓度的测定。按照冯宗慈等改进的比色法，使用 UV2450 紫外可见分光光度计（Shimadzu Corporation, Japan）进行测定。

　　1.4 试验数据统计及分析

　　试验数据采用 SAS（8.2 版）的 MIXED 过程统计，不同活性酵母间的差异与相同活性酵母不同添加水平间的差异采用 CONTRAST 语句进行比较。统计差异显着性定义为P<0.05。

　　2 结果与分析
　　
　　2.1 两种酵母不同添加水平对粗饲料体外发酵产气量和相关参数的影响

　　2.1.1 两种酵母不同添加水平对玉米秸秆体外发酵产气量和相关参数的影响 图 1 与图 2 分别为以玉米秸秆为发酵底物时，安琪和乐斯福两种酵母不同添加水平对体外发酵产气曲线的影响。【图1-2】

　　
　　表 4 为以玉米秸秆为发酵底物时，安琪和乐斯福两种酵母不同添加水平对体外发酵产气相关参数的影响。通过图 1、图 2 和表 4 可以看出，以玉米秸秆作为发酵底物时，添加安琪和乐斯福两种酵母对体外发酵参数 Vf 值、d值、k 值、FRD0值和 t0.5值均无显着影响（P>0.05），而添加乐斯福酵母的发酵参数 b 值显着低于安琪酵母（P<0.05）。安琪酵母不同添加水平对 Vf 值、b 值、d 值和 k 值均无显着影响（P>0.05）；而对 FRD0值和 t0.5值均存在显着的一次效应（P<0.05）。乐斯福酵母不同添加水平对 Vf 值没有显着影响（P>0.05）；而对 b 值、FRD0值和 t0.5值均存在显着的三次效应（P<0.05），对 d 值和 k 值均存在显着的二次效应（P<0.05）。酵母类型与添加水平对 Vf 值、d 值和 k 值均没有表现出显着的互作效应（P>0.05）；而对 b 值、FRD0值和 t0.5值表现出显着的互作效应（P<0.05）。随着安琪酵母添加水平的增加，FRD0值呈显着的增加趋势，当添加水平为 0.075%时达到最大；而 t0.5值则呈显着的下降趋势，当添加水平为 0.075%时达到最小。

　　2.1.2 两种酵母不同添加水平对水稻秸秆体外发酵产气量和相关参数的影响 安琪和乐斯福两种酵母不同添加水平对水稻秸秆体外发酵产气曲线的影响如图 3、图 4 所示。【图3-4】

　　以水稻秸秆为发酵底物时，安琪和乐斯福两种酵母不同添加水平对体外发酵产气相关参数的影响如表 5 所示。

　　通过图 3、图 4 和表 5 可以看出，以水稻秸秆作为发酵底物时，添加安琪和乐斯福两种酵母对各体外发酵参数均无显着影响（P>0.05）。乐斯福酵母不同添加水平对体外发酵各参数均存在显着的三次效应（P<0.05），各参数随添加水平的升高呈先降低、随后升高、又再次降低的趋势。安琪酵母不同添加水平对 Vf 值、b 值和 FRD0值均无显着影响（P>0.05）；而对d 值存在显着的二次效应（P<0.05），对 k 值和 t0.5值存在显着的一次效应（P<0.01）。酵母类型与添加水平对 Vf 值和 t0.5值表现出显着的互作效应（P<0.05），对 d 值和 FRD0值表现出极显着的互作效应（P<0.01）；而对 b 值和 k 值没有表现出显着的互作效应（P>0.05）。随着乐斯福酵母添加水平的增加，FRD0值呈整体上升趋势，当添加水平为 0.075%时 FRD0值达到最大。【表4.表5略】

　　
　　2.2 两种酵母不同添加水平对粗饲料体外发酵 DMD 和NDFD 的影响

　　2.2.1 两种酵母不同添加水平对玉米秸秆体外发酵 DMD 和NDFD 数的影响 以玉米秸秆为体外发酵底物时，安琪和乐斯福酵母不同添加水平对 DMD 和 NDFD 的影响见表 6。

　　通过表 6 可以得出，添加乐斯福酵母时玉米秸秆的 DMD显着高于添加安琪酵母（P<0.05），但两种活性酵母不同添加水平之间玉米秸秆 DMD 并不存在显着性差异（P>0.05），同时 DMD 呈随乐斯福酵母添加水平提高而升高的趋势。酵母与添加水平之间也未表现出显着的交互效应（P>0.05）。酵母类型对 NDFD 没有显着影响（P>0.05），乐斯福酵母添加水平和酵母与添加水平之间的互作均对 NDFD 没有显着性影响；但安琪酵母添加水平对 NDFD 的影响呈极显着的二次效应（P<0.01）。【表6】

　　
　　2.2.2 两种酵母不同添加水平对水稻秸秆体外发酵 DMD 和NDFD 数的影响 添加两种酵母对水稻秸秆体外发酵 DMD及 NDFD 的影响如表 7 所示。

　　通过表 7 可知，两种酵母对水稻秸秆 DMD 的影响达到了极显着水平（P<0.01），并且酵母和添加水平之间亦存在极显着的交互效应（P<0.01）；安琪酵母不同添加水平对水稻秸秆 DMD 无显着影响（P>0.05），而乐斯福酵母添加水平对DMD 的影响呈极显着的一次效应（P<0.01）。对于 NDFD 而言，两种酵母、酵母添加水平以及酵母和添加水平的交互效应对 NDFD 均无显着影响（P>0.05）。【表7】

　　
　　2.3 两种酵母不同添加水平对粗饲料体外发酵 pH 和NH3-N 的影响
　　
　　2.3.1 两种酵母不同添加水平对玉米秸秆体外发酵 pH 和NH3-N 的影响 表 8 所示为以玉米秸秆为发酵底物时，添加安琪和乐斯福两种酵母对体外发酵液 pH 和 NH3-N 的影响。

　　由表 8 可以得出，添加两种酵母对以玉米秸秆为底物的体外发酵液 pH 值无显着性影响（P>0.05），酵母与添加水平之间的互作效应也未达到显着性水平（P>0.05），安琪酵母各添加水平之间对 pH 值表现出极显着的一次效应（P<0.01），而乐斯福酵母各添加水平之间对 pH 值则表现出显着的二次效应（P<0.05）。对 NDFD 而言，两种酵母、酵母添加水平以及酵母和添加水平的交互效应对 NDFD 均无显着影响（P>0.05）。【表8】

　　
　　2.3.2 两种酵母不同添加水平对水稻秸秆体外发酵 pH 和NH3-N 的影响 以水稻秸秆作为发酵底物时，添加安琪和乐斯福两种酵母对体外发酵液 pH 和 NH3-N 的影响如表 9所示。【表9】

　　通过表 9 可以发现，添加安琪和乐斯福两种酵母对以水稻秸秆为底物的体外发酵液 pH 值和 NH3-N 浓度均有显着影响（P<0.05），且两种酵母添加水平、酵母和添加水平的交互作用对 pH 值和 NH3-N 浓度呈显着影响（P<0.05）。安琪酵母不同添加水平间的 pH 值和 NH3-N 浓度均表现出显着的二次效应 （P<0.05），乐斯福酵母各添加水平间的 pH 值和NH3-N 浓度则呈现出极显着的一次效应（P<0.01）。

　　3 结论与讨论
　　
　　3.1 结论
　　
　　本试验通过奶牛瘤胃体外发酵技术，初步探究并比较了安琪酵母与乐斯福酵母对于瘤胃发酵特性的影响。得出以下结论：

　　（1）添加安琪和乐斯福两种酵母对玉米秸秆和水稻秸秆两种底物体外发酵的产气量和 LE 产气参数均无显着影响，然而均显着地提高了玉米秸秆和水稻秸秆的 DMD。

　　（2）添加两种酵母对以玉米秸秆为发酵底物的体外发酵液 pH 值及 NH3-N 浓度均未表现出显着性效应，但是分别显着地降低了以水稻秸秆为发酵底物的体外发酵液 pH 值及NH3-N 浓度。乐斯福酵母对于以玉米秸秆和水稻秸秆 DMD的提高作用均显着高于安琪酵母；对 NH3-N 浓度的降低作用也显着地高于安琪酵母。

　　（3）从总体数据结果来看，水稻秸秆的发酵效果要好于玉米秸秆；乐斯福酵母的添加效果要明显优于安琪酵母，并且 0.075%为其最佳添加水平。

　　3.2 讨论

　　体外发酵产气量一定程度上可以反映出发酵底物为瘤胃微生物所利用的程度，因此通过测定两种酵母不同添加水平下体外发酵的产气量，可以粗略地估计其对于 DMD 的影响。本试验研究结果显示，添加活性酵母并未对以玉米秸秆和水稻秸秆为底物的体外发酵产气量产生显着性影响，且目前也缺乏与之相关的研究报告与本试验的这一结果进行比较。FRD0表示体外发酵 12h 之前的发酵初期产气速率，t0.5值则表示产气量达到最大理论产气量一半所需要的发酵时间。本试验以玉米秸秆为底物的体外发酵中，FRD0值均表现出随着两种活性酵母添加水平的提高而增大的趋势，且 t0.5值也表现出随着酵母添加水平的提高而减小的趋势，这一现象表明随着两种酵母添加水平的提高，在发酵前期均能加快玉米秸秆降解速率、进而加快产气速率、增加产气量的趋势，而这一趋势之所以未能达到显着水平，可能是因为试验中酵母的添加水平还不足以导致显着性影响。在以水稻秸秆为底物的体外发酵中，添加两种酵母却有增大 t0.5值的趋势，表明两种酵母有降低发酵前期产气量的趋势。玉米秸秆与水稻秸秆两者之间的这一差别可能与两种底物之间的营养成分差异相关。

　　DM 和 NDF 降解率是体现瘤胃发酵过程中粗饲料利用率的重要指标。在本试验中，添加酵母显着地提高了玉米秸秆的 DMD，并极显着地提高了水稻秸秆的 DMD。有研究表明添加酵母菌能够增加瘤胃中纤维分解菌的数量，而纤维分解菌所分泌的纤维素酶能够显着的提高粗饲料体外发酵的DMD，本试验的这一结果与之相吻合。另外，一般认为发酵产气量与 DMD 紧密相关，但本试验中添加酵母并未对体外发酵产气量产生显着性影响，这可能是因为本试验所选用的两种酵母改变了底物的降解方式，从而使底物更多地通过生成气体（CO2、CH4等）较少的反应途径实现降解。尤其当以玉米秸秆为发酵底物时，添加乐斯福酵母的 DMD 要显着高于安琪酵母；而以水稻秸秆为发酵底物时，添加乐斯福酵母的 DMD 更是极显着地高于安琪酵母，这说明乐斯福酵母对于粗饲料降解的效果要明显优于安琪酵母。然而，不管是以玉米秸秆作为发酵底物或是以水稻秸秆作为发酵底物，添加两种酵母对两者的 NDFD 均无显着性作用。这种结果的出现一方面可能是因为本试验所选用的两种酵母并不能增强NDF 相关酶的分泌或活性；另一方面也有可能是本试验酵母的添加水平还不足以导致对 NDFD 的显着性影响。

　　瘤胃 pH 值是评价瘤胃发酵状况的基本指标，决定着瘤胃微生物对底物的发酵利用效率。维持正常的瘤胃 pH 值是保证瘤胃正常发酵的必要前提，而奶牛瘤胃液 pH 值的正常范围为 5.5-7.5。Van Houtert 认为，瘤胃微生物最大生长速度的 pH 值在 5.7 以上。本试验以玉米秸秆作为发酵底物时，所有的 pH 值都处于正常范围内；以水稻秸秆作为发酵底物时，乐斯福酵母处理组的 pH 值显着的低于安琪酵母处理组，并且随着添加水平的升高而逐渐降低，所有处理的 pH 值也均处于正常范围内。这说明添加酵母对于维持瘤胃内环境的稳衡具有一定的积极作用。

　　瘤胃 NH3-N 浓度在一定程度上反映出特定日粮条件下蛋白质降解与合成间的平衡状态，NH3-N 是瘤胃微生物合成微生物蛋白和机体蛋白的主要原料，其最佳浓度范围为63-275mg/L。本试验中各处理组的 NH3-N 浓度均落在最佳范围之内，并且以水稻秸秆作为发酵底物时，乐斯福酵母处理组的 NH3-N 浓度要显着低于安琪处理组，并且随着添加水平的提高而降低；而前面已经提到以水稻秸秆作为底物时，乐斯福酵母处理组的 DMD 要极显着高于安琪酵母组，而且随着添加水平的提高而升高。这一联系表明 NH3-N 浓度与 DMD 之间可能存在有密切的关联，可能是因为添加乐斯福酵母提高了 DMD 而加快了物质与能量的代谢进程，从而需要更多的微生物蛋白及机体蛋白以维持代谢平衡，因此促进了对 NH3-N 的利用而降低了 NH3-N 浓度，但是此推测需要足够的相关试验研究加以论证。

　　本试验初步探究并比较了两种酵母对奶牛瘤胃两种底物体外发酵的影响，然而酵母作用于瘤胃发酵特性的具体途径及机制还不够明确，这还有待于通过进一步的体外试验以及动物试验而得到更充分更透彻的研究。