抑制素基因疫苗对奶牛产后子宫复旧的影响

　　抑制素(INH)是由卵巢分泌的糖蛋白质激素，能抑制垂体促卵泡素(FSH)的分泌。用 INH 免疫奶牛能进一步提高超排效果，且能增加胚胎数，提高胚胎质量。抑制素基因疫苗因其制备简单、构建成本低、纯度高而受到关注。研究表明，单拷贝抑制素基因疫苗和双拷贝抑制素基因疫苗均可诱导小鼠、大鼠、绵羊、黄牛产生抗抑制素抗体，同时提高 FSH 分泌水平，促进卵泡发育。但是目前尚缺少抑制素基因疫苗对子宫发育状况方面的研究。

　　以上提到的单拷贝、双拷贝抑制素基因疫苗，其抑制素基因均构建在含抗性标记的质粒 PGISI 上，而有抗性标记的疫苗在实际生产中无法推广应用。韩丽等利用“asd–减毒沙门氏菌–宿主平衡致死系统”构建了无抗生素筛选的抑制素重组菌 C500(PXAIS)基因疫苗，该疫苗以猪霍乱沙门氏菌弱毒株 C500 为载体传递抑制素基因疫苗。将 C500(pXAIS)重组菌以1010CFU/mL 的剂量免疫小鼠后，可显著提高抗小鼠抑制素抗体水平，明显增强小鼠的免疫效果。本研究用 C500(PXAIS)免疫产后奶牛，以探讨抑制素基因疫苗对奶牛产后子宫复旧的影响，为抑制素基因疫苗应用于奶牛生产提供参考数据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 供试菌株C500(pXAIS)重组菌由华中农业大学杨利国教授赠送。

　　1.1.2 供试奶牛从湖南省畜牧兽医研究所奶牛场选择胎次为 2~4胎、健康无疾病的24 头中国荷斯坦奶牛用于试验。

　　1.2 方 法
　　
　　1.2.1 疫苗的制备将重组菌C500(pXAIS)接种于LB液体培养基，37 ℃振摇培养至菌液 OD600 nm=0.3~0.4，1 500×g 离心 10 min 收集细菌，用灭菌 PBS 调整细菌浓度至1010、109、108CFU/mL。

　　1.2.2 试验分组及免疫依据年龄、胎次、产奶量、体重、膘情，将供试奶牛随机分为 4 组：高剂量免疫组(T1)、中剂量免疫组(T2)、低剂量免疫组(T3)和对照组(CK)，每组6 头奶牛。高、中、低剂量免疫组奶牛在产后第 7天按 3 种剂量进行初次免疫，即分别肌肉注射 1010、109、108CFU/mL 重组菌 C500(pXAIS)，每头注射 3mL；对照组奶牛分别注射 3 mL 10%生理盐水。初次免疫后间隔 28 d，用同等剂量疫苗对各组加强免疫 1 次。

　　1.2.3 血样检测分别在初次免疫后 14、28 d，加强免疫后 14、28 d，用真空采血管采集奶牛尾中动脉血样约 5mL，3 500×g 离心 10 min，分离血清，–20 ℃保存。

　　用 ELISA 方法检测奶牛血清中抗抑制素抗体效价，以人工合成的抑制素融合蛋白作为标准包被抗原进行包被，血样稀释80倍，以P/N值>2判为阳性(其中 P 为待测血样的吸光值，N 为阴性对照血样吸光值)。

　　1.2.4 子宫观察从产后第 7 天开始，用 B 型兽用超声扫描仪(DP–3300vet 全数字便携式超声诊断机，Mindary 公司)检测产后奶牛子宫孕角和子宫颈的复旧情况，每3 d 检测 1 次，直到子宫完全恢复(产后子宫颈和子宫孕角直径恢复到与未孕子宫相似时可认为子宫完全恢复)。

　　1.2.5 统计分析抗体 P/N 值、子宫颈和子宫孕角直径用“平均数±标准差”表示，用 SPSS18.0 统计软件对各项数据进行统计分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 非抗性筛选抑制素基因疫苗免疫对奶牛抗抑制素抗体水平的影响

　　由表 1 可知，各免疫组奶牛的抗抑制素抗体的P/N 值均高于对照组，且高、中剂量免疫组奶牛的抗体 P/N 值显著高于对照组奶牛的抗体 P/N 值(P<0.05)；高剂量免疫组(T1)奶牛的抗抑制素抗体P/N 在初次免疫和加强免疫后均为最高，而低剂量免疫组(T3)奶牛的抗体 P/N 在初次免疫和加强免疫后均为最低；且 T1组与 T3组差异均有统计学意义(P<0.05)。与初次免疫期相比较，各免疫组在加强免疫后第 14 d 的抗体 P/N 值均提高，且 P/N 值的变化规律一致，即在第一次免疫后不断上升，在加强免疫第 14 天达高峰。加强免疫后，各免疫组抗抑制素抗体阳性率均上升，其中加强免疫第 14 天时T1组达 83.33%(表 2)。以上结果说明，在本试验条件下，抑制素基因疫苗(C500(pXAIS))免疫奶牛可诱导产生抗抑制素抗体，且高剂量免疫组的免疫效果最佳。【表1-2】

　　
　　2.2 非抗性筛选抑制素基因疫苗免疫对奶牛产后子宫复旧的影响

　　B 超检测结果表明，高、中、低剂量免疫组奶牛产后至子宫颈恢复的间隔时间均短于对照组，但差异没有统计学意义(P>0.05)；产后至子宫孕角恢复的间隔时间均短于对照组，且高剂量免疫组与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05) (表 3)。奶牛免疫抑制素基因疫苗后 30 d 内，子宫颈直径逐渐变短，趋向于恢复正常大小，在前 21 d 子宫颈恢复快，后 7 d 恢复减弱(图 1)；子宫孕角直径逐渐变短，趋向于恢复正常大小(图 2)，在前 21 d 产后子宫孕角恢复较快，后 7 d 恢复较慢(图 3)。【图1.图2略.图3.表3】

　　
　　3 讨 论

　　本试验结果中，按 3 个不同剂量(1010、109、108CFU/mL)分别对产后奶牛肌肉注射 C500(pXAIS)重组菌 3 mL 后，3 个免疫组奶牛抗抑制素抗体水平均上升，加强免疫后高剂量免疫组(1010CFU/mL)的抗抑制素抗体阳性牛比例达83.33%(5/6)，表明C500(pXAIS)抑制素基因疫苗对奶牛有很好的免疫原性。随着免疫剂量的增加，奶牛免疫应答效果增强，呈现剂量依赖关系。 Liang 等用低、中和高剂量生长抑制素基因疫苗免疫动物，中剂量基因疫苗的免疫应答效果最好，这可能是由于核酸疫苗的免疫剂量不仅受免疫途径和方法、质粒的大小的影响，还受局部细胞摄取 DNA 能力、质粒转染效率和抗原提呈效率等因素的影响。本研究结果表明，抑制素基因疫苗免疫能诱导产后奶牛产生免疫应答，但影响其免疫效果的因素(免疫剂量、免疫方式及加强免疫次数等)还需进一步分析。

　　延长奶牛产后开放期将会导致奶牛场巨大经济损失，因此，奶牛产后子宫复旧和卵巢功能恢复对确保产后奶牛再次受孕及缩短产犊间隔时间非常重要。本研究结果显示，高剂量(1010CFU/mL)重组菌(C500–pXAIS)基因免疫可显著减少奶牛产后子宫孕角的恢复时间，这可能是高剂量基因疫苗免疫引起的较高免疫应答促进机体子宫组织结构恢复的结果。