孤雌胚胎及其干细胞的印记基因表达研究

　　1. 小鼠孤雌生殖研究现状及意义

　　在自然界中蜜蜂、蚂蚁等较为低等的动物存在孤雌生殖现象，而哺乳动物在正常情况下都不能获得孤雌发育来源的个体。研究哺乳动物的孤雌生殖却有重要的意义，它不仅能够为我们提供理想的科研模型以逐渐揭开生命神秘的面纱[1,2],同时也能作为一种基因治疗材料避开伦理与道德的限制应用于基因治疗、器官移植、组织修复、疾病治疗等医学领域[3 ~5].

　　自从 20 世纪 70 年代开始研究小鼠孤雌生殖以来，激活后的孤雌胚胎在体内发育最多不能超过10. 5d,原因是孤雌胚胎着床后胚外组织发育缺失和印记基因表达模式的异常[6].随着研究的进一步深入，在孤雌胚胎着床发育方面取得了巨大进步，尤其是近几年来通过连续核移植和基因修饰等技术手段，如构建出包含成熟卵与未成熟卵基因组的孤雌胚胎，改善了一些印记基因的表达，进而能够发育到13. 5d.敲除 H19 基因中长度为 3kb 的一段序列后，获得的突变小鼠的未成熟卵作为供体核移植到去核的成熟卵中构建孤雌 ngH19 △ 3/ fgwt胚胎，Igf2/H19 的顺式调控作用受到影响，使得孤雌胚胎体内发育增加到 17. 5d.当敲除 H19 基因的一段长度为13kb 的 序 列 后，应 用 连 续 核 移 植 的 方 法 构 建ngH19 △ 13/ fgwt孤雌胚胎能够发育到成年并产生后代[7,8].

　　随着孤雌胚胎二倍体和单倍体干细胞的获得与深入研究，拓宽了小鼠孤雌生殖的研究领域和再生医学应用范围。例如： 通过分离小鼠孤雌囊胚内细胞团建立的胚胎干细胞直接注射到四倍体囊胚腔内，获得了能够发育出生的仔鼠[9]; 构建出地中海贫血疾病模型小鼠的孤雌胚胎干细胞，为该疾病的基因治疗提供了理论指导[10]; 体外使用高浓度莱鲍苷 A（ reboudioside,RA） 等药物诱导孤雌胚胎干细胞可促使其分化成为运动神经元[11],使用特异药物N2 诱导处理，也获得了类似神经样的细胞[12]; 孤雌胚胎干细胞在肝和心肌等组织的修复与治疗方面占据重要地位[3,13].用 si-RNA 介导方法敲低 H19 基因后 BMP4 表达量升高，并且更接近于正常受精的胚胎干细胞的状态，可以作为细胞治疗的潜在来源[14].孤雌单倍体细胞可类似卵细胞核那样提供母源基因物质并产生正常的后代[15].但是其在培养过程中会自发二倍体化，需要流式细胞术进行不停地筛选，最近研究发现，向培养体系中添加适量的Week1 激酶的一种小分子抑制剂可以调节细胞周期，原理为加速 G2期向 M 期过渡的同时并抑制细胞进入 G1/ S 期，结果导致不用流式细胞术筛选干细胞就可以维持单倍性达到 4 周以上[16].综上所述，我们认为小鼠孤雌胚胎干细胞具有巨大的研究价值和潜在的医疗价值。目前除了小鼠以外，还成功建立了兔、猪、猴的孤雌胚胎干细胞系并诱导分化成为具有功能的细胞或组织[17 ~19].有研究报道，人类孤雌胚胎干细胞（ human parthenogenetic embryonicstemcells,hpES） 可以分化形成胰岛样细胞团（ lsletlike clusters,ILCs） 并具有与胰岛相同的生理功能，有可能作为治疗 1 型糖尿病的可靠材料[20].hpES还可以分化为神经干细胞（ hpNSCs） 并能成功移植到啮齿类和非人灵长类（ nonhuman primates,NHPs）帕金森病（ parkinson's disease,PD） 模型动物中，检测移植 hpNSCs 后的 PD 模型动物，发现多巴胺呈较高水平表达，并无任何不良反应，暗示 hpNSCs 可以作为细胞移植治疗的种子细胞[21].

　　2. 小鼠孤雌胚胎及干细胞中的印记基因表达

　　在哺乳动物中，胚胎的正常发育必需具备双亲的遗传物质。父源和母源的某些等位基因经过表观修饰后存在差异表达的情况，称为基因印记，这些基因被称为印记基因。在正常受精的小鼠胚胎发育中，印记基因要经过印记的擦除、重建和维持 3 个动态平衡的过程： 首先在胚胎发育的 10. 5 ~13. 5d,也就是原始生殖细胞迁移进入性腺时期，完成亲源印记的擦除； 之后在配子发生过程中逐步建立了不同于亲代的特异印记模式，其中，精子在形成单倍体之前就完成了印记的建立，卵子相对较晚，在 MⅡ期才能完全建立； 新的印记模式一旦建立就需要在子代体细胞中终生维持下去[22,23].

　　2. 1 孤雌胚胎中印记基因表达： 在孤雌二倍体胚胎中没有父源遗传物质的存在，只含有两套母源基因组且印记基因的表达发生了改变，例如一些母源印记丢失，父源印记基因的异常表达，这可能是导致哺乳动物孤雌发育失败的最主要原因。目前普遍认为甲基化作用是调控基因印记的主要作用机制[24].

　　印记基因所在区域 CpG 岛的甲基化水平高低决定了该印记基因表达与否，若甲基化水平较低则该印记基因呈表达状态，反之则被印记[25].有研究发现，在 8-细胞时期检测 Peg1/Mest、Snrpn 和 Igf2r 基因的甲基化水平，在正常受精的胚胎中包含甲基化和未甲基化的等位基因，孤雌胚胎中的等位基因几乎全部是甲基化的。当发育到囊胚期时孤雌胚胎发生了印记的丢失，即理论上甲基化水平应该为100% ,实际测得的值却在 60% ~ 70% 之间，印记的丢失可能是由于体外培养引起的[26].此外，定位于小鼠 11 号染色体的父源表达的印记基因 U2afbp-rs在第 9. 5 天开始表达，孤雌胎儿中检测到的表达量仅是正常受精胎儿的 88%,其表达量的减少与染色质的开放式结构相关而与甲基化作用无关[27].随着研究的深入，陆续地发现了很多参与胚体和胚外组织发育的重要印记基因如 Igf2r、H19、Igf2、Snrpn在孤雌胚胎中的甲基化水平发生了异常改变[28].

　　我们依此推论，若是能够采用适当的方案调控孤雌胚胎中的甲基化作用，就有可能促进孤雌胚胎中印记基因表达模式趋向于正常受精胚胎。

　　2. 2 孤雌胚胎干细胞的印记表达： 应用基因芯片技术分析孤雌二倍体胚胎干细胞和正常受精胚胎干细胞中基因表达谱的情况，结果发现： 在孤雌胚胎干细胞中，总共有 3276 ~ 3329 个基因表达情况异常，大约 2029 个基因表达呈上调状态，其余的下调。其中对胚胎发育具有重要意义的基因约有 88% （ 96/109） 发生改变； 另外检测印记基因发现，父源表达的印记基因中： Mcts2、Mest、Zfp264、Snrpn、Nap1l5、Impact、Dlk1、Ddc 上调，Igf2 下调； 母源表达的印记基 因 Pon2、Cdkn1c、 Grb10、 Rian、Igf2r、 Gnas、Ube3a、Phlda2 全部下调[29].有研究表明，Dlk1-Dio3印记结构域能够作为检测小鼠诱导性多能干细胞（ induced pluripotent stem cells,iPSCs） 及胚胎干细胞（ emberyonic stem cells,ES） 分化潜能的指标，这个结构域的基因表达水平越高则 iPSCs 或 ES 的分化潜能越强，反之则低[30].以 Dlk1-Dio3 区域印记基因高表达的 iPSCs 为供体细胞可以出生四倍体补偿的小鼠[31].Dlk1-Dio3 结构域包含 3 个父源差异甲基 化 区 （ DMRs） : IG-DMR、Gtl2-DMR 和 Dlk1-DMR,其 表 达 受 到 父 源 甲 基 化 印 记 调 控 区（ imprinting control regions,ICR） 和非编码 RNA（ noncoding RNA,ncRNA） 的调控[32,33].

　　近几年研究发现，向处于 MⅡ期的卵内注射一个精子并同时移除该卵的染色体，平衡一段时间后再向胞质内注射一个孤雌单倍体胚胎干细胞，获得了能够产生正常后代的个体，亚硫酸盐检测结果发现，该个体的 Snrpn 和 H19 基因甲基化水平与正常小鼠相近[34].以上结果显示，孤雌单倍体胚胎干细胞能够代替卵中的母源基因组来行使功能，并且小鼠的正常发育必需同时具备双亲的遗传物质。目前认为在正常受精的小鼠胚胎中，引起印记基因沉默主要有以下两种途径： 第 1,未甲基化的印记调控元件（ imprint control element,ICE） 启动子区非编码 RNA 的表达引起印记基因沉默； 第 2,由CCCTC 结合因子（ CCCTC binding factor,CTCF） 介导未甲基化 ICE 亲源特异的绝缘子活化而引起沉默。此外还发现，那些远离 ICE 的印记基因簇仅在胚外组织中表达，并且受到不同表观调控机制的修饰[35].由此我们能够推论，在孤雌胚胎和孤雌胚胎干细胞中，印记基因的表达发生异常改变可能是印记调控元件区相关基因异常激活或抑制所引起的，但其明确的机制目前尚无定论。

　　3. 胚胎聚合后小鼠孤雌发育及印记表达

　　所谓孤雌胚胎聚合是指孤雌激活来源的胚胎卵裂球质膜相互接触形成一个新的并能够继续卵裂的胚胎。聚合胚胎的染色体倍数并不发生改变，仅是同时期孤雌胚胎卵裂球数目的加倍，聚合胚胎的发育时程并不发生明显的变化。其制作过程为： 将两个处于 8-细胞时期的孤雌胚胎去掉透明带，然后将其移入预先用无菌针扎坑的培养皿中，待卵裂球间建立细胞连接并能继续卵裂后就获得了孤雌聚合胚胎[36].我们制作了两个 8-细胞时期聚合的小鼠孤雌胚胎同时用其建立了相应的孤雌聚合胚胎干细胞（ aggregation parthenogenetic embryonic stem cells,aPgES） 并进行了相关的检测与鉴定（ 图 1） .结果发现，与不聚合的小鼠孤雌胚胎及干细胞相比，聚合后发生了一定的改变。首先，聚合囊胚的内细胞团数目明显多于不聚合的，聚合囊胚的体积相对较大。

　　检测孤雌聚合囊胚与不聚合孤雌囊胚中印记基因的表达，发现父源表达的印记基因在两者间的水平相近且都低于正常受精的囊胚，母源表达的印记基因在聚合囊胚中水平明显低于不聚囊胚更趋近于正常受精的囊胚； 其次，与不聚合的孤雌胚胎干细胞（ parthenogenetic embryonic stem cells,PgES） 相比，聚合作用能够明显地提升建系效率至 48. 39%.aPgES 在碱性磷酸酶着色、核型、体内外分化能力等方面与 PgES 有着相近的结果。对比印记基因表达情况，我们发现，聚合作用能够抑制孤雌胚胎干细胞中母源表达的印记基因，同时活化父源表达的印记基因[36].

　　我们知道，小鼠孤雌胚胎具有很高的纯合性，这种高度纯合性可能是导致了孤雌发育失败的一个重要原因。胚胎聚合增加了内细胞团数目和孤雌胚胎的杂合性，这可能是导致建系效率提高及父源基因高表达的原因之一； 另外，聚合作用可能弥补不同胚胎间的印记差异，例如在一个孤雌胚胎中的某些母源印记基因是高表达的，在另一个中表达水平低，把两者聚合后可能会发生印记间的补偿，从而使聚合胚胎印记基因表达水平趋于正常。但明确的机制还有待进一步的研究。

　　4. 展望

　　孤雌胚胎及孤雌胚胎干细胞作为一种理想的研究材料和医疗原料具有非常广阔的发展前景，不仅能够巧妙地避开道德和伦理的限制，而且还具有广泛的来源和简便的获得方法，同时，对两者印记基因表达情况的探讨也有助于揭示哺乳动物孤雌发育失败的机制。但是孤雌胚胎体内发育时间短、孤雌胚胎干细胞建系效率低且全能性差，是目前研究的难关和热点。许多实验通过基因修饰或核移植等技术手段提高了小鼠孤雌胚胎体内发育时间和干细胞的分化能力，但是这种技术的难度系数较大不易操作。

　　然而，胚胎聚合的操作既简单又方便，相比于核移植与基因修饰等技术具有明显优势，聚合后的干细胞建系率有明显的升高，印记基因的表达水平相对于不聚合的更趋近于正常受精的胚胎干细胞。如果增加聚合胚胎的数目或提早聚合的时期，就有可能获得印记基因表达更接近于正常的小鼠孤雌聚合胚胎干细胞。