NO对拟南芥气孔发育的调节作用

　　引言

　　气孔作为植物与外界环境进行气体交换（主要是CO2和H2O）的重要通道，在调节植物光合作用、蒸腾作用以及水分利用中扮演 着 至 关 重 要 的 角色[1].近年来通过研究气孔发育异常的突变体，发现了许多调控气孔发育的基因，因此对气孔发育基本遗传途径的认识越来越清晰。植物气孔发育受到多种环境因素影响，如二氧化碳和水蒸气，而研究表明一氧化氮（nitric oxide,NO）作为广泛分布于生物体内的活性小分子，参与了植物生长发育的许多过程[2].那么NO是否也能影响植物气孔发育，目前还没有相关报道，为了探究NO在气孔发育过程中的功能，本实验利用外源NO处理，以及NO含量变化突变 体，证 明NO调 节 拟 南 芥 气 孔 发 育 过 程，qRT-PCR结果表明，NO影响气孔发育相关基因MUTE、SCRM及SCRM2的表达。本结果为植物气孔发育的调控提供了新的证据，对于改良植物的抗旱性具有重要的理论价值。

　　1 材料与方法

　　1.1材料及处理方法

　　实 验 所 用 野 生 型 拟 南 芥 （Arabidopsisthaliana L.）为Columbia-0生态型，拟南芥突变体nox1（CS3156）和noa1（CS6511）均购于拟南芥信息资源库（The Arabidopsis Information Resource）拟南 芥 种 子 经 过 消 毒 液 （5% NaClO和0.01%Triton X-100）消毒5min后，无菌水清洗3次，4℃春化3d后播种于含1%蔗糖和0.8%琼脂的1/2MS培养基（pH 5.8）。

　　外源SNP处理时，先将种子在1/2MS培养基中萌发1d,然后移至提前添加不同浓度SNP的1/2MS培养基中，SNP浓度分别为0、10、20、30和40μmol·L-1.以上材料均置于拟南芥培养箱中，培养温度为22℃,光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为100μmol·m-2·s-1,湿度为80%~90%.

　　1.2实验方法
　　
　　1.2.1显微技术取新鲜叶片投入脱色液（V乙醇 ∶V乙酸 =19∶1）中脱色1h,再将脱去叶绿素的叶片浸入透明剂中透明1h,然后用Olympus BX60微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope,DIC）照相。透明剂配方为：水合氯醛80g,甘油10mL,用水定容至100mL.

　　1.2.2气孔相关参数统计野生 型WT,突 变 体nox1（CS3156）和noa1（CS6511）三个株系分别随机选择十株七天的幼苗，观察统计幼苗子叶下表皮的气孔指数（stomatal in-dex,SI）和%（GMC+M）。拍照时每个子叶拍摄两个不重叠、避开叶脉和叶边缘的图片，借助ImageJ软件来统计SI和%（GMC+M），实验重复3次。

　　拟南芥的气孔发育要经历三种不同的前体细胞：拟分生组织母细胞（MMC）、拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）[3],为了更全面准确地分析气孔发育过程，一般将SI和%（GMC+M）作为衡量气孔发育 的 指 标。

　　SI=气 孔 数/（气 孔 数+表 皮 细 胞数）；%（GMC+M）=（保卫母细胞数+分生组织细胞数）/（保卫母细胞数+分生组织细胞数+气孔数+表皮细胞数）[4].实验数据用Microsoft Excel 2003软件进行处理，采用Origin 8软件作图，本文中所有统计作图中Error bars代 表 标 准 误 差 均 值。星 号 代 表 通 过student t test计算出的差异的显着性程度（*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001）。

　　1.2.3 RNA提取和qRT-PCRRNA提取：用Trizol（Invitrogen）提取生长七天幼苗的子叶RNA,每个株系选取100株幼苗，实验 重复3次，具体步骤如下：液氮研磨幼苗，加入1mL的Trizol,剧烈震荡15s,室温静置5min后移至冰上，4℃，12 000rpm,15min离心后取上层红色液体于新的EP管中，之后加入200μL氯仿震荡15s,室温静置2min.4 ℃，12 000rpm,15min离心后取上清于新的EP管中，加入500μL异丙醇，室温静置30min后再次4℃，12 000rpm,15min离心，吸去管中液体，留管底白色沉淀，用70%乙醇吹打沉淀使其悬浮，4 ℃，7 500rpm,5min离心后吸去乙醇，将EP管置于超净台干燥，最后加入20μLDEPC H2O溶解沉淀。