NO对拟南芥气孔发育的调节作用(2)

　　RNA反转录：用TOYOBO的反转录试剂盒将提取好的RNA反转为cDNA.总反应体系为20μL,反应程序为：RNA 1~2μɡ,oligo（dT）5pmol,10mmol·L-1dNTP 1μL,DEPC H2O补足到14μL,65℃孵育5min,取出后放置于冰上，向反应体系加入5×Reaction Buffer 4μL,RNase Inhibitor1μL,42℃保温2min后，加入1μL反转录酶，于42℃反应50min之后，72℃孵育15min将反转录酶灭活。反应结束后样品降温至4℃，cDNA保存于-20℃备用。

　　荧光定量PCR:定量分析气孔发育相关基因的表达量，先 按 照 上 述 方 法 提 取RNA,反 转 录 成cDNA,本实验使用UBQ5作为内参基因，实验所用引物序列见表1,扩增中SYBR-green作为荧光染料，反应程序为：95℃ 3min,95℃ 15s,58℃ 15s,72℃15s,读取荧光值，重复上述步骤，45个循环；95℃10s;60℃到95℃做 溶 解 曲 线，每5s升 温0.5℃并读取一次荧光值。

　　所有实验都进行了3次以上的重复，每次生物重复 都 包 含3次 技 术 重 复。 使 用Comparativethreshold cycle（Ct）方法来计算扩增产物的相对量。
　　
　　2 结果与讨论

　　2.1外源NO对拟南芥叶片气孔发育的影响

　　环境因素能够影响气孔运动，也能影响气孔发育。在拟南芥中，提高CO2水平能够降低植物的气孔密度（单位叶面积内的气孔数目）[5],最新研究表明，编码β-碳酸酐酶的两个基因CA1,CA2和CO2诱导产生的蛋白酶CRSP共同参与了CO2对气孔发育的影响[6].高光强也能提高气孔指数[7].目前已知NO能够激活MAPK信号通路[8],而MAPK信号级联在气孔发育中起至关重要的作用[9].

　　SNP处理WT后统计幼苗子叶下表皮的气孔指数和%（GMC+M），如图1,外源SNP处理使拟南芥幼苗子叶下表皮的气孔数增多，拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）数目增多；SNP处理提高了拟南芥气SI和%（GMC+M），并且在10~30μmol·L-1SNP浓 度 范 围 内，随 着 浓 度 升 高，SI和%（GMC+M）均显着增加。实验结果表明，外源NO能提高SI和%（GMC+M）
　　
　　2.2拟南芥内源

　　NO含量变化对气孔发育的影响观察WT,noa1,nox1萌发七天的幼苗子叶下表皮，统计SI和%（GMC+M），如图2,NO降低突变体noa1子叶表皮的气孔数少于WT,而NO升高突变体nox1子叶表皮的气孔数目和拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）数目均高于WT;NO含量降低突变体noa1的SI和%（GMC+M）均显着低于WT,而NO含量升高突变体nox1的SI和%（GMC+M）均显着高于WT.

　　2.3 NO影响气孔发育相关基因的表达

　　近年来发现了许多调控气孔发育的基因，研究发现拟南芥中有五个编码bHLH蛋白的基因调控气孔 世 系 的 起 始 和 发 展，包 括SPEECHLESS（SPCH）、MUTE、FAMA、SCRM（ICE）、SCRM2[10,11].SCRM和SCRM2通 过 与 三 个bHLH转录因子形成异二聚体，分别特化气孔发育中的三步级联：

　　SPCH和SCRM/SCRM2启动气孔世系的第一次不对称分裂，而MUTE和SCRM/SCRM2促进拟分生组织细胞向保卫母细胞（GuardMother Cell,GMC）的转变。

　　研究表明，mute突变体中，拟分生组织细胞（M）增多，而在scrm1-2中GMC-like细胞增多，scrm1-2scrm2-1/+中拟分生组织细胞（M）增多[11].而我们的结果表明，NO也会导致%（GMC+M）升高，为了探究NO是否通过这些基因调控%（GMC+M）,利用qRT-PCR技术，比较分析了WT、nox1、noa1中气孔发育相关基因MUTE、SCRM和1的表达，如图3,结果显示，nox1中MUTE,SCRM和SCRM2三个基因的表达均低于WT,而noa1中这三个基因的表达均高于WT.同时，30μM SNP处理WT后，MUTE,SCRM和SCRM2表达水平均低于对照组，和nox1一致，表明NO影响了气孔发育相关基因MUTE,SCRM和SCRM2的表达。

　　以 上 结 果 表 明，NO可 能 通 过 调 控MUTE,SCRM和SCRM2三个基因的表达影响了拟南芥气孔发育过程中的细胞转变，使更多的细胞停留在拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）时期，因此导致了%（GMC+M）水平的提高。目前尚不清楚NO如何在阻碍部分细胞分化的同时提高SI,由于影响气孔发育有多条信号通路[12],因此我们推测NO可能通过影响其他基因来影响气孔指数。

　　3 结论
　　
　　SNP处理WT后的SI和%（GMC+M）均高于对照 组，并 且NO升 高 突 变 体nox1的SI和%（GMC+M）显着高于WT,而NO降低突变体noa1的SI和%（GMC+M）均低于WT.这些内源NO含量变化突变体气孔的异常发育表明，内源NO对于拟 南 芥 气 孔 发 育 具 有 重 要 的 作 用。

　　MUTE、SCRM和SCRM2调控气孔发育，MUTE促进拟分生组 织 细 胞 （M）向 保 卫 母 细 胞 （GMC）的 转 变，SCRM和SCRM2所编码的蛋白以二聚体的形式辅助MUTE行使功能已见报 道，qRT-PCR结 果表明，nox1中MUTE、SCRM、SCRM2的表达水平均低于WT,外源SNP处理结果与nox1一致，而noa11MUTE、SCRM、SCRM2的 表 达 水 平 均 高 于WT.综 上 所 述，NO可 提 高 拟 南 芥 的SI和%（GMC+ M）水 平，同 时 调 控 气 孔 发 育 相 关 基 因MUTE、SCRM、SCRM2的表达。

　　NO作为一种重要的信号分子，通过调控基因的转录水平以及转录后蛋白修饰参与植物发育过程。同时，植物气孔的发育受多条信号途径的调节。

　　本实验 的 结 果 表 明，NO可 能 通 过 调 控MUTE、SCRM、SCRM2等基因的表达影响拟南芥气孔发育1%（GMC+M）的水平。关于NO如何调控这些基因的表达，以及如何影响SI还需要进一步的研究和探索。