致病菌检测中碳量子点荧光探针的运用

　　摘    要：　环境中的各类致病菌是危害人类健康的潜在因素，相应的快速、精准检测方法的开发具有重要意义。碳量子点作为一种具有卓越的荧光性能、良好的荧光稳定性与生物安全性、易于化学修饰和功能化等性质的新型碳纳米材料，在致病菌检测方面极具发展潜力，并且碳量子点荧光探针检测技术操作简单、检测快速、不需要大型仪器设备。近年来，碳量子点的综述主要集中在制备方法及性质等方面，鲜有碳量子点荧光探针在致病菌检测方面进展的描述。本文简述了碳量子点的特性，分析了三种碳量子点荧光探针在致病菌检测中的应用，提出了碳量子点与磁性纳米材料和特异性识别物质相结合，构建灵敏度高、特异性强的磁性碳量子点复合荧光探针是碳量子点在致病菌检测方面的重要发展方向。

　　关键词：　碳量子点; 荧光探针; 致病菌; 检测;

　　Abstract：　All kinds of pathogenic microorganisms in the environment are potential causes harmful to human health. The development of corresponding rapid and accurate detection methods is of great significance. As a new type of carbon nanomaterial, carbon quantum dots display excellent fluorescence performance, good fluorescence stability, good biosafety, and are easy to be chemically modified and functionalized, so they have great development potential in the detection of pathogenic microorganisms. Moreover, the detection technology using carbon quantum dots is simple to operate and does not require large-scale instruments and equipment. In recent years, the review of carbon quantum dots mainly focuses on the preparation methods and properties, and the research progress of carbon quantum dots fluorescent probes in the detection of pathogenic microorganisms is rarely described. This paper briefly describes the characteristics of carbon quantum dots, analyzes the application of three kinds of carbon quantum dots fluorescent probes in the detection of pathogenic microorganisms. Finally, this paper proposed that the combination of carbon quantum dots with magnetic nanomaterials and specific recognition materials to construct magnetic carbon quantum dots composite fluorescent probes with high sensitivity and specificity is an important development direction of carbon quantum dots in pathogenic microorganism detection.

　　Keyword：　carbon quantum dots; fluorescent probe; pathogenic microorganisms; detection;
 

　　细菌、真菌等微生物作为自然界的重要组成部分几乎无处不在，其中的部分微生物会威胁人类的健康，被称为致病菌。例如：金黄色葡萄球菌、鼠疫耶尔森氏菌、白色念珠菌等。这些致病菌的存在对人类健康构成相当大的风险，特别是对病人、孕妇、婴儿、幼儿和其他免疫系统受损的人。目前致病菌主要的检测方法有传统的生物学检测法、酶联免疫吸附法和聚合酶链式反应等，这些方法虽然能够达到检测致病菌的目的，但是存在一定的缺陷。如：传统的生物学检测方法费时耗力[1]；酶联免疫吸附法除价格较高外[2]，活性酶易变性，需要特殊储存[3]；聚合酶链式反应检测时间较长且可能出现假阳性问题[4]。因此，快速、精准的致病菌检测技术的研究和开发得到了人们的广泛重视。碳量子点（Carbon quantum dots，CQDs）自2004年[5]被发现以来，因其独特的光学性能迅速成为了科学研究的一个热点。卓越的荧光性能、良好的荧光稳定性、易于化学修饰和功能化等性质使得碳量子点荧光探针在致病菌检测方面极具发展潜力。与传统的致病菌检测方法相比，碳量子点荧光探针检测技术操作简单、检测快速、不需要大型仪器设备；与含镉、砷等重金属的量子点荧光探针相比，碳量子点具有不弱于量子点的荧光性能、低廉的制备成本以及环境友好的性质，故被科研工作者广泛关注。本文简要介绍了碳量子点的特性，重点对碳量子点荧光探针在致病菌检测中的应用进行了详细的综述。

　　1 、碳量子点的特性

　　1.1 、荧光性质

　　碳量子点是一种以碳为骨架的新型纳米材料，尺寸一般只有几纳米，结构呈现为类球形且分散性良好，如图1所示，其最基本也是最显着的性质是荧光特性。光致发光性、激发波长相关性和上转换发光特性是碳量子点最主要的三种荧光特性。光致发光性是物体从外部光源接收能量并激发，从而发出光的现象。Li等人[6]通过实验发现，随着碳量子点粒径大小的变化，其发射光的波长和强度也在不断变化，这种现象被称为量子尺寸效应。到目前为止，对碳量子点光致发光的机制主要有三种解释，一是共轭π域引起的能级跃迁[7]，二是电子-空穴对的复合发光[8]，三是分子态发光[9]。激发波长相关性是指碳量子点受到不同波长的光照射会发出不同波长和强度的荧光。Zheng 等人[10]通过实验证明激发波长相关性可能与CQDs表面基团的缺陷有关，该发现佐证了电子-空穴对复合发光的机理。上转换发光特性是指发射波长小于激发波长的光学现象，又称为反斯托克斯效应。目前为止，碳量子点上转换特性的来源有以下三种解释，一是源于物质同时吸收两个或两个以上的光子[11]，二是源于从高能态的π轨道到σ轨道的电子弛豫[12]，三是源于荧光光谱仪中衍射光的泄露[13]。目前，科学家们在碳量子点荧光现象的解释中仍存在一些争议，还需要对碳量子点及其荧光性质进行更深入的研究。

　　1.2、 荧光稳定性

　　荧光性能稳定是碳量子点与传统有机荧光试剂相比的一个突出优势。荧光稳定性包括抗光漂白性、储存稳定性、抗离子干扰性等[14]。Sun等人[15]对碳量子点的抗光漂白性进行了研究，实验发现被氙灯连续照射6 h的碳量子点的荧光强度没有发生任何变化，表明碳量子点具有良好的抗光漂白性；Zhang等人[16]以抗坏血酸为原料制备了一种碳量子点，将该碳量子点于常温下储存6个月后发现其荧光性质未发生明显变化，说明碳量子点具有良好的储存稳定性；Shi等人[17]为研究碳量子点的荧光稳定性，将制备好的碳量子点放入浓度高达2 mol/ L的NaCl溶液中，储存6个月后，发现其荧光强度没有发生变化，表明碳量子点具有良好的储存稳定性和抗离子干扰性。碳量子点的荧光性能稳定这一特性使得碳量子点荧光探针在复杂环境中检测致病菌时大大减少了非特异性连接造成的错误响应，并且可延长实验观察时间。同时碳量子点所表现出的优异的荧光特性，在分析检测、发光材料以及药物运载等众多领域具有极大的应用价值[18,19,20,21]。

　　1.3 、易于化学修饰和功能化

　　碳量子点易于化学修饰和功能化是由于其表面含有丰富的含氧基团，如羟基、羧基等。碳量子点的修饰主要分为三类：1）胺类化合物对碳量子点进行表面钝化；2）杂原子掺杂；3）功能化修饰[22]。表面钝化和杂原子掺杂能够大大提高碳量子点的荧光强度，如Wang等人[23]使用聚乙二醇对碳量子点进行表面钝化，结果发现碳量子点的量子产率大大提高；Yang等人[24]分别对碳量子点进行了氮掺杂和硫掺杂，结果发现碳量子点的荧光强度都得到了明显提高。另外，还可以通过表面钝化的方法改变碳量子点的发光性质，如Tan等人[25]使用多聚精氨酸对碳量子点进行表面钝化后，得到了发射绿色和蓝色荧光的碳量子点。碳量子点的功能化修饰是通过碳量子点复合其它纳米材料或特异性识别物质来实现的。Lai等人[26]使用叶酸（Fa）对碳量子点进行功能化修饰，修饰后的碳量子点对叶酸受体过表达的肿瘤细胞具有高度的选择性。目前，科研工作者们通过功能化修饰的碳量子点建立表面能量转移系统造成荧光猝灭实现了对金属离子[27]、黄曲霉毒素[28]等物质的检测。除此之外，研究者们通过功能化修饰的碳量子点特异性识别作用与致病菌结合，通过检测致病菌表面碳量子点的荧光强度实现了对致病菌的定量检测，同时通过使用不同的特异性识别物质对碳量子点进行修饰，实现了对不同致病菌的检测。

　　图1 碳量子点及其表面基团示意图

　　Fig.1　Schematic diagram of carbon quantum dots and their surface groups

　　2 、碳量子点荧光探针在致病菌检测中的应用

　　碳量子点因其卓越的荧光性能、良好的稳定性、易于化学修饰和功能化等性质，在致病菌检测方面极具潜力，受到了研究者们的广泛关注，基于碳量子点荧光探针的多种致病菌检测方法被成功开发和应用。

　　2.1、 荧光探针

　　Mandal等人[29]以稻秆废料作为碳源制备了一种表面富含羧基的碳量子点，将其应用于污水中细菌的检测，发现该碳量子点表面的羧基很容易与细菌表面的蛋白质、多肽或氨基酸结合，利用荧光显微镜获得多种颜色的细菌细胞图像进而计算出细菌总数，检测时间为30~40 min；Wang等人[30]以蔗糖为原料制备了一种碳量子点，应用于大肠杆菌的定量检测，结果发现该碳量子点在350 nm和410 nm的激发波长照射下，最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值Log[I(F410)/ I(F350)]与大肠杆菌浓度的对数值呈现一定的线性关系，大肠杆菌的检出限低至10 cfu/mL。Liu等人[31]以大豆和芝麻为原料制备了两种碳量子点，简称为CQDs1和CQDs2，将其应用于真菌的检测中发现，这两种碳量子点能够穿透白色念珠菌和新型隐球菌的真菌外膜并在这两种致病真菌体内稳定发光，但是这两种碳量子点对白色念珠菌和新型隐球菌的选择性结合效果存在差异，基于这种差异，他们将CQDs1成功应用于小鼠肺部新型隐球菌的检测，检测结果发现随着小鼠感染隐球菌程度的增加，检测到的荧光强度也逐渐增强。

　　上述研究表明，碳量子点可以通过结合到菌体表面或进入菌体体内的方法实现对细菌或真菌的检测，但该方法的专一性并不强，无法实现复杂背景环境中特定菌的精确检测。

　　2.2 、复合荧光探针

　　碳量子点在食源性致病菌检测方面的应用还可以通过碳量子点与特异性识别物质如适配体、抗生素以及生物分子（包括抗体、糖类）结合为复合荧光探针的方式实现，利用复合探针荧光强度的变化进行对诸如大肠埃希氏菌、沙门氏菌的检测，这种检测方法大大提高了碳量子点荧光探针的抗干扰能力和专一性。表1总结了碳量子点复合荧光探针在致病菌检测中的一些应用。

　　表1　碳量子点复合荧光探针检测致病菌

　　2.2.1、 碳量子点偶联适配体

　　基于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的催化作用，Wang等人[32]将适配体以酰胺键的形式固定到碳量子点表面，制备得到了具有特异性的碳量子点-适配体（CQDs-Apt）复合荧光探针。基于该适配体与鼠伤寒沙门氏菌膜蛋白的特异性结合作用，将复合荧光探针CQDs-Apt用于鼠伤寒沙门氏菌的敏感定量检测，结果表明，该探针能定量检测菌浓度在103~105 cfu/mL范围内的鼠伤寒沙门氏菌，检出限低至50 cfu/mL，除此之外，通过对鸡蛋和自来水中目标菌的检测，验证了该复合荧光探针的实用性。

　　2.2.2、 碳量子点偶联抗生素

　　Zhong等人[33]利用碳量子点卓越的荧光性能，以及万古霉素与细胞壁之间的相互作用，成功建立了一种细菌检测方法：首先使用EDC和NHS活化碳量子点表面的羧基，再加入万古霉素，万古霉素以酰胺键的形式固定到碳量子点表面形成了万古霉素-碳量子点的复合物，将该复合物作为荧光探针加入金黄色葡萄球菌培养液中孵育一段时间，孵育结束后使用离心机将菌体分离，然后重悬于缓冲溶液中。荧光分光光度计检测结果显示，对金黄色葡萄球菌的检测范围为3.15×105~1.59×108 cfu/mL，检出限为9.40×104 cfu/mL。Soumen等人[34]，以柠檬酸氢铵和能够特异性结合革兰氏阴性菌的阿米卡星为原料采用水热碳化法一步合成了阿米卡星修饰的碳量子点，基于阿米卡星与革兰氏阴性菌的特异性结合作用，将该碳量子点荧光探针应用于大肠杆菌的定量检测，实验结果显示，该碳量子点对大肠杆菌具有较好的检测效果，检测范围为7.625×102~3.904×105 cfu/mL，检出限为552 cfu/mL。值得注意的是，目前碳量子点应用于致病菌检测的报道主要是对致病细菌的检测，应用于检测致病真菌的报道并不多见。基于两性霉素B（AmpB）与真菌细胞膜上的麦角固醇特异性结合的作用，2019年本课题组[36]成功建立了一种真菌检测方法：将碳量子点与AmpB在NHS和EDC的作用下进行复合，制备了N-CQDs@AmpB复合荧光探针，将该探针应用于白色念珠菌的检测，实验结果显示，探针的荧光强度与白色念珠菌的菌浓度成一定的线性关系，计算得到该方法的检出限为1 124 cfu/mL。另外，抗生素滥用造成的环境问题对人类健康的危害值得深思，因此该类荧光探针的使用和回收问题是日后研究的重要方面。

　　2.2.3 、碳量子点偶联生物分子

　　基于甘露糖与大肠杆菌菌毛末端凝集素的特异性结合，Zhao等人[37]以柠檬酸和乙二胺为原料制备得到表面富含羧基的碳量子点，碳量子点表面的羧基经EDC和NHS活化后与氨基甘露糖的氨基发生酰胺化反应，形成了一种氨基甘露糖和碳量子点的复合物Man-CQDs，将该复合物作为荧光探针应用于大肠杆菌 JM109和沙门氏菌S.123443的检测，结果表明，Man-CQDs能够使甘露糖从菌毛末端脱落，自身与致病菌结合，通过计算可以得出Man-CQDs与这两种致病菌的结合常数。而Lai等人[26]将碳量子点和甘露糖充分混合后直接加热合成了甘露糖修饰的碳量子点Man-CQDs，甘露糖在这个过程中通过羧基与羟基的脱水偶联而固定到碳量子点表面，将Man-CQDs作为荧光探针加入大肠杆菌的培养液中，结果表明，在一定范围内Man-CQDs的荧光强度随着大肠杆菌菌浓度的增加而增强，大肠杆菌的检出限低至102 cfu/mL。Che等人[44]利用碳量子点成功取代传统染料构建免疫荧光探针应用于大肠杆菌的检测，在EDC和NHS的作用下，将碳量子点和大肠杆菌抗体通过酰胺键的形式结合为复合免疫荧光探针，应用于大肠杆菌O157: H7的特异性识别，结果表明，该探针成功标记到大肠杆菌O157: H7表面。为了实现致病菌的现场快速检测，Li等人[38]利用鼠疫耶尔森氏菌特异性抗体和碳量子点制备了一种免疫层析试纸，该试纸采用了双抗体夹心的免疫层析原理，仅依靠肉眼即可分辨阴性和阳性，经条件优化后敏感性可达到105 cfu/mL。

　　当前研究表明，碳量子点与特异性识别物质结合为复合荧光探针能够快速、精准地检测细菌和真菌。其检测机理是：将能特异性结合细菌或真菌的物质与碳量子点进行偶联制得复合荧光探针，利用该物质能特异性结合菌的作用将探针附着到所检测致病菌的表面，碳量子点为探针提供荧光性能，显示检测结果。具体过程如图2所示。复合荧光探针的制备方法主要有两种：一种是利用NHS和EDC对碳量子点表面的羧基进行活化，再与特异性识别物质的氨基进行偶联形成酰胺键；另一种是将特异性物质与碳源一步水热碳化通过酰胺键的方式固定到碳量子点表面。但该检测方法仍存在不足，复合荧光探针与目标菌孵育结束后，通常需要多次离心富集致病菌，增加了检测时间和探针脱落的风险。

　　图2　碳量子点复合荧光探针检测致病菌示意图

　　Fig.2　Schematic diagram of pathogenic microorganisms detected by carbon quantum dots fluorescent probes

　　2.3 、磁性复合荧光探针

　　为了提高致病菌的检测效率，研究者们将碳量子点与磁性纳米材料联合使用。Bhaisare等人[39]将醋酸、壳聚糖和磁纳米粒子加入反应釜中通过一步水热法制备出磁性碳量子点（Mag-CQDs），基于Mag-CQDs的荧光特性和磁分离作用，将Mag-CQDs作为荧光探针分别加入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养液中进行定量检测，结果发现，测得的荧光强度与目标菌的数量呈正相关，该荧光探针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检出限分别为3×102 cfu/mL和3.5×102 cfu/mL，值得一提的是，该磁性碳量子点荧光探针只需2 min即可富集目标菌。

　　基于磁性纳米材料的磁分离作用、碳量子点的荧光性质以及适配体的特异性识别作用，Che等人[40]分别制备了磁性纳米粒子Fe3O4@SiO2-NH2和荧光碳纳米粒子CQDs，在NHS和EDC的作用下，通过酰胺化反应将两种纳米材料结合在一起，制备出磁性碳量子点Fe3O4@CQDs，为了使该磁性碳量子点对沙门氏菌具有专一性，他们将沙门氏菌适配体修饰到Fe3O4@CQDs表面制得Fe3O4@CQDs-Apt。将Fe3O4@CQDs-Apt作为荧光探针对沙门氏菌进行检测，结果表明，Fe3O4@CQDs-Apt能够定量检测沙门氏菌，检测范围为103~106 cfu/mL，检出限为103 cfu/mL。值得一提的是，该磁性复合荧光探针在复杂样品中仍能有效检测目标菌。

　　Zhao等人[42]将CQDs和磁珠表面的羧基用EDC和NHS活化后分别与氨基甘露糖以酰胺键的形式结合在一起，制备了Man-Fe3O4纳米探针和Man-CQDs纳米探针，利用这两种纳米探针建立了一种检测沙门氏菌的新方法。首先，利用Man-Fe3O4纳米探针，在外部磁场的作用下选择性结合并富集目标细菌，再利用Man-CQDs纳米探针标记到目标菌表面，结果显示，该双探针检测方法对沙门氏菌定量检测的菌浓度范围为104~107 cfu/mL，检出限为5×103 cfu/mL。

　　上述研究发现，磁性碳量子点荧光探针结合目标菌后，磁分离作用能够实现目标菌的快速富集，提高碳量子点荧光探针的检测效率，且碳量子点荧光探针具有较好的检测灵敏度。该方法检测致病菌可以概括为三步：1）磁性碳量子点荧光探针接触致病菌时，通过偶联物质的特异性识别作用结合到致病菌表面；2）磁性碳量子点荧光探针在外加磁场的作用下，通过磁性组件实现对致病菌的快速富集；3）利用仪器对富集后的致病菌进行荧光检测。

　　3 、结语与展望

　　碳量子点作为一种主要由C、H、O三种元素组成的新型纳米材料，因其独特的光学性质、低毒无害、易于化学修饰和功能化等特性，在众多领域得到了广泛的应用。虽然研究人员对碳量子点进行了大量的研究，但在其荧光性质的解释方面仍存在争议。

　　碳量子点荧光探针由于具有构建简单、检测速度快、不需要大型仪器设备的特点，在致病菌检测方面极具发展潜力。但是，碳量子点作为荧光探针仍存在一些不足，如在实际样品分析中，复杂的检测背景可能会对碳量子点荧光探针的特异性和灵敏度产生影响；碳量子点偶联抗生素构建的荧光探针，易对环境造成污染；碳量子点对致病真菌检测的研究报道比较少。这些不足之处是碳量子点荧光探针在致病菌检测方面需要完善的重要方面。在荧光探针的构建方面，碳量子点与特异性识别物质如适配体、抗生素以及生物分子结合为复合荧光探针，大大提高了碳量子点荧光探针的抗干扰能力和专一性，但该方法通常需要经过多次离心富集致病菌，增加了检测时间；碳量子点与磁性纳米材料联合使用，利用磁分离作用富集致病菌有利于提高荧光探针的检测效率。因此，碳量子点与磁性纳米材料和特异性识别物质相结合，构建灵敏度高、特异性强的磁性复合荧光探针，是碳量子点在致病菌检测方面的重要发展方向。

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