荧光探针分子接力识别研究成果综述

　　由于在化学分析、环境监测、生命科学和生物医学等诸多领域的广泛应用，荧光探针的设计、合成与应用研究已经成为当前非常活跃的研究领域之一[1 ~9].荧光探针用于金属离子和阴离子的检测，具有方法简单、灵敏度高、选择性好及响应速度快等优点。此外，很多荧光探针还可以用于活细胞和生物体内的金属离子或阴离子的显影跟踪。至今已有种类繁多、数量庞大的基于各种识别机制而设计合成的荧光探针被报道。绝大多数已经报道的荧光探针都是针对某一特定离子的高选择性识别而设计的，在满足专一性识别功能的同时，这种荧光探针和被检测离子“一对一”的定制合成方式也大大增加了合成研究的工作量。为了深度开发利用荧光探针分子的功能，很多国内外研究者把目光转向了多功能荧光探针，即利用一个荧光探针分子通过多种信号通道响应（ 如荧光光谱、紫外-可见光谱、氧化还原电位等）[10 ~14]或调控溶剂体系[15 ~17]等方法实现其多离子识别功能。可是，已报道的多功能荧光探针在识别不同的目标离子时，通常需要大量摸索测试的溶剂条件或综合运用不同类型的检测信号模式才能达到多功能识别的目的，因此造成检测过程复杂，也为实际应用带来一定的困难。

　　接力识别是荧光探针分子功能强化的一个新方向。所谓接力识别是指探针分子在一定条件下对某一离子进行选择性识别后，利用原位生成的中间产物（ 新的中间体或者是配合物） 与新的离子物种间的特殊作用直接在原测试条件下继续进行新的离子识别。显然，接力识别型荧光探针能够使得两种离子的识别操作可在同一测试条件下连续进行，具有操作简单的显著优点，并能降低探针合成的工作量，有利于节能减排。

　　按照接力识别过程中的离子类型，已报道的接力识别研究可以分为四种类型： 金属离子和阴离子的接力识别、阴离子和金属离子的接力识别、金属离子和金属离子的接力识别及阴离子和阴离子的接力识别。本文将对以上四种类型接力识别研究的主要进展加以介绍。

　　1 金属离子和阴离子的接力识别

　　由于金属离子和阴离子电荷互补，某些“荧光探针-金属离子”络合物又可以作为间接识别阴离子的荧光探针，并具有实时响应的优点，所以设计合成对特定金属离子和阴离子具有接力识别功能的荧光探针备受关注，并已经成为当前接力识别荧光探针研究的主要方向。

　　1. 1 Zn2 +和阴离子的接力识别

    2011 年，Ghosh 等[18]设计合成了基于喹啉衍生物的荧光分子探针 1,其在 100% 水溶液（ pH =7. 4） 中可以通过螯合增强荧光机制选择性地识别 Zn2 +,原位生成的 1-Zn2 +络合物可以接力识别焦磷酸根（ PPi） ,1-Zn2 +与 PPi 继续络合后造成荧光猝灭。

　　2011 年，Yamato 等[19]设计合成了含芘的荧光探针 2.在乙腈/二氯甲烷（ 1000∶ 1,此处及下文的混合溶剂比例均为体积比） 中，探针 2 与Zn2 +结合后破坏了原有的激基缔合物（ excimer）的形成，使长波长荧光猝灭，芘单体的荧光得以增强。原位生成的 2-Zn2 +与 H2PO4-结合后，又能重新形成部分 excimer,引起荧光增强。通过excimer 的破坏与形成实现了 Zn2 +和 H2PO4-的接力识别。

　　Zn2 +的结合比由最初的 2∶ 1变为 1∶ 1,荧光发射发生了红移，并且发射强度先增强后降低。当向1∶ 1的3-Zn2 +络合物中进一步加入 PPi 时，荧光发射发生蓝移并增强。紫外吸收光谱和荧光光谱研究结果表明其他磷酸类阴离子如磷酸根和三磷酸核苷酸等不能诱导产生类似 PPi 引起的荧光发射变化，体现了探针 3-Zn2 +和 PPi 之间独特的结合作用。

　　2013 年，Singh 等[21]合成了一种席夫碱类的多重响应型荧光探针 4.在 N,N-二甲基甲酰胺/H2O （ 7∶ 3） 溶液中，探针 4 与 Zn2 +结合后荧光显著增强，该过程是通过抑制激发态分子内质子转移（ ESIPT） 和电荷转移（ CT） 过程而引起的。原位生成的 4-Zn2 +的络合物可以通过金属离子取代途径用于识别磷酸根，表现为荧光猝灭。磷酸化的生物分子如 ATP、ADP、AMP、NADP 及 NAD等也可以引起类似的荧光光谱变化。

　　2013 年，Das 等[22]报道了由 8-氨基喹啉缩合而得 的 双 席 夫 碱 型 荧 光 探 针 5.在 甲 醇/水（ 3∶ 2,HEPES 1mmol/L,pH 7. 4） 中，5 对 Zn2 +具有高度选择性，结合比为 2∶ 1,5 与 Zn2 +结合后抑制了 C = N 键的异构化，导致荧光增强。原位生成 5-Zn2 +络合物对 PPi 具有选择性识别作用，PPi先与5-Zn2 +结合，然后夺取 Zn2 +释放出5,荧光被猝灭。

　　2013 年，Kumar等[23]报道了一种基于萘二酰亚胺结构的比率型荧光探针 6,该探针在水/乙腈（ 2∶ 8） 中可以比率型识别 Zn2 +.原位生成的 6-Zn2 +能接力识别 PPi 和 H2O2.PPi 与 Zn2 +结合后，降低了 6 与 Zn2 +的结合作用，引起 6 的荧光恢复，而 H2O2与 Zn2 +的结合作用较弱，尽管可引起荧光猝灭和蓝移，却不能使 6 的发射得以恢复。此外，6 还可用于活细胞内 Zn2 +的成像。

　　2013 年，Tang 等[24]报道了一种含二-（ 吡啶亚甲基） 胺的苯并咪唑衍生物 7 作为比率型 Zn2 +荧光探针。在乙腈/水 （ 2∶ 8,HEPES 10mmol/L,pH = 7. 4） 溶液中，探针 7 具有典型的 ESIPT 荧光团的双发射性质。7 与 Zn2 +结合后，ESIPT 过程受到抑制，产生一个新的发射峰。当向原位生成的 7-Zn2 +络合物中加入 S2 -时，Zn2 +被夺取出来释放出自由的探针 7,其荧光性质得到恢复。通过 ESIPT 的调控（ 先抑制后恢复） 实现了 Zn2 +和S2 -的比率信号接力识别。与 7 具有相似结构的化合物 8,可用于在纯水溶液中对 Zn2 +和 S2 -的比率信号接力识别[25].

　　2014 年，Jiang 等[26]基于光诱导电子转移（ PET） 和 C = N 异构化机制设计合成了荧光探针9.在甲醇溶液中该探针与 Zn2 +结合，抑制了PET 过程及 C = N 的异构化，引起荧光增强，但是该探针对其他金属离子的抗干扰能力稍差。原位生成的 9-Zn2 +络合物可通过金属离子取代途径识别 H2PO4-,发生荧光猝灭。

　　1. 2 Cu2 +和阴离子的接力识别

    近年来，笔者课题组报道了一系列 Cu2 +和阴离子的接力识别能力的探针化合物（ 10 ~ 17） .化合物 10 是含苯并咪唑结构的席夫碱型荧光探针，其 在 甲 醇/水 （ 1/1, HEPES 10mmol/L,pH = 7. 0） 溶液中能高选择性识别 Cu2 +并发生荧光猝灭。原位生成的 10-Cu2 +络合物与 CN-作用后，通过 CN-夺取 Cu2 +释放出探针 10,使其荧光恢复。探针 10 对 Cu2 +及 10-Cu2 +络合物对 CN-的检测限分别为1. 82 ×10- 8mol / L 和 1. 62 × 10- 6mol /L.探针 10 对 Cu2 +和 CN-接力识别的功能使其在实际样品中 Cu2 +和 CN-的检测方面具有潜在的应用价值[27].

　　化合物 11 是一种喹唑啉类荧光探针，该探针在甲醇/水（ 1∶ 1,pH =7. 0） 溶液中对 Cu2 +具有高度选择性，由于铜离子的顺磁性造成荧光猝灭。原位生成 11-Cu2 +络合物可以接力识别 CN-,CN-可以将 Cu2 +从配合物中夺取出来，11 的荧光信号得到恢复[28].

　　2013 年，我们报道了荧光探针 12[29].有趣的是，12 对 Cu2 +和 CN-具有荧光信号连续增强的接力识别功能。在水溶液中（ pH =7. 0） 中该探针与 Cu2 +以 2∶ 1的比例相结合，络合后增强了荧光团 的 刚 性 导 致 其 荧 光 增 强。原 位 生 成 的12-Cu2 +络合物能继续与 CN-结合（ Cu2 +未被夺取） ,CN-向中心 Cu2 +的供电子效应削弱了喹唑啉结构向 Cu2 +的 PET 效应，从而引起荧光发射继续增强。这种在金属离子和阴离子的相继作用下荧光信号连续增强的接力识别目前还鲜见报道。

　　图式 1 推测的 12-Cu2 +及 12-Cu2 +-CN-的结合模式Scheme 1 Proposed binding modes of 12-Cu2 +and12-Cu2 +-CN-complex近两年，笔者课题组还相继报道了几个可在100% 水溶液中对 Cu2 +和 S2 -进行接力识别的荧光探针。化合物 13 是一种新的荧光和比色双通道响应的探针。13 在 100% 水溶液（ pH = 7. 4）中，通过显著的颜色和荧光变化表现出对 Cu2 +的高选择性、高灵敏度识别。原位生成的 13-Cu2 +络合物通过荧光猝灭对 S2 -显示出高度选择性，而其他阴离子和含巯基的氨基酸对荧光信号没有明显影响。探针 13 对 Cu2 +和 S2 -的接力识别过程均可快速响应。

　　随后，我们使用一个简单的苯并咪唑类荧光探针 14 也实现了 Cu2 +和 S2 -的高选择性接力识别[31].在 100%水溶液（ pH =6. 0） 中，14 与 Cu2 +结合后发生荧光猝灭。原位生成的 14-Cu2 +络合物通过 S2 -对 Cu2 +置换，荧光恢复。14 对 Cu2 +及14-Cu2 +络合物对 S2 -的检测限分别为 3. 5 ×10- 7mol / L 和 1. 35 × 10- 6mol / L.实验结果表明，荧光分子探针 14 在实际水样中对 Cu2 +和 S2 -的检测具有潜在的应用价值。此外，笔者课题组报道的荧光探针 15[32]、16[33]和 17[34]都实现了在100% 水溶液中通过荧光信号的“开-关-开”变化对 Cu2 +和 S2 -的接力识别。

　　2011 年，Zhu 等[35]报道了一种新型的手性荧光探针 18.它作为一种“开-关”荧光探针在水溶液（ pH =7. 3） 中与 Cu2 +结合后，荧光猝灭。尽管18 没有直接显示出对映选择性，但其结合 Cu2 +后，原位生成的 18-Cu2 +络合物对 α-氨基酸表现出显著的荧光增强和较好的对映选择性。

　　2012 年，Shao 等[36]合 成 一 种 新 的 基 于BODIPY 荧光团的探针 19,可作为“开-关 ”型Cu2 +荧光探针，并具有高度选择性和灵敏度。探针 19 与 Cu2 +结合后荧光猝灭，这是由于发生了配体向金属离子的电荷转移（ LMCT） 过程而造成的。19-Cu2 +可作为一种有效的“关-开”型荧光探针高效识别高半胱氨酸（ Hcy） 及半胱氨酸（ Cys） .

　　2012 年，Jang 等[37]报道了荧光探针 20,可在乙腈溶液中选择性识别 Cu2 +,荧光发射由弱变强，二者的结合比为 1∶ 1.在乙腈/水 （ 8∶ 2） 中原位生成的 20-Cu2 +络合物能够通过 Cu2 +置换途径选择性识别 I-.20-Cu2 +与 I-作用后，I-夺取Cu2 +造成荧光猝灭。

　　2013 年，Feng 等[38]直接使用 1,1'-联二萘酚作为 Cu2 +荧光探针。在乙腈/水 （ 1∶ 1） 溶液中，被测试的金属离子中只有 Cu2 +能够引起 1,1'-联二萘酚在 360nm 处的荧光完全猝灭，这是由于 1,1'-联二萘酚被 Cu2 +氧化成了化合物 21,并形成了一个 Cu-21 络合物。继续向该体系中加入含有巯基的氨基酸如 Cys、Hcy 及谷胱甘肽（ GSH） 后，在 482nm 处出现一个新的发射峰，这是由于含有巯基的氨基酸可将铜离子从 Cu-21 络合物中夺取出来，使溶液表现为 21 的荧光发射。而其他天然氨基酸不能引起类似的荧光光谱变化。

　　2013 年，笔者课题组[39]利用“点击”反应合成了喹啉衍生物 22 并将其用作荧光探针。在二甲基亚砜/水（ 1/1,HEPES 20mmol/L,pH = 7. 4）中22 能接力识别 Cu2 +和 PPi.探针22 与 Cu2 +结合后，荧光被猝灭，显示出探针 22 对 Cu2 +具有高选择性。原位生成的 22-Cu2 +对 PPi 具有高度选择性识别作用，加入 PPi 能引起荧光恢复。Cu2 +和 PPi 的识别过程均具有良好的抗干扰能力。

　　2013 年，Pitchumani 等[40]报道了一种环糊精接枝黄酮的荧光分子探针 23.核欧佛豪瑟效应频谱（ NOESY） 以及发射光谱研究表明黄酮部分的苯环被嵌入环糊精空腔中。探针 23 与 Cu2 +结合后发生荧光猝灭，当继续加入 L-组氨酸时荧光恢复。L-组氨酸将 Cu2 +从 23-Cu2 +络合物中夺出并释放出 23,导致其荧光信号恢复。由此可见，探针 23 可以特异性识别 Cu2 +和 L-组氨酸。

　　1. 3 Hg2 +和阴离子的接力识别

    2012 年，Wu 等[41]合成了一种若丹明衍生物24 官能化的硅纳米粒子 RFSNP,并将其用作识别多种离子的荧光探针。RFSNP 与 Hg2 +结合后在578nm 处 的 荧 光 显 著 增 强，RFSNP-Hg2 +与H2PO4-结合后，荧光继续增强并发生 19nm 的蓝移，实验证明 H2PO4-是以氢键形式继续与 24 中的仲胺侧链结合而不是与 Hg2 +离子络合。向RFSNP-Hg2 +中 加 入 S2 -后，荧 光 信 号 恢 复 至RFSNP 的发射光谱。RFSNP 具有低毒性和良好的细胞膜渗透性，可用于活细胞成像。

　　2013 年 Singh 等[42]采用化合物 25 在水溶液中聚集成的荧光有机纳米颗粒作为荧光探针。所得的荧光有机纳米颗粒在水溶液（ pH =7. 4） 中对Hg2 +表现出良好的选择性和灵敏度，与 Hg2 +结合后荧光猝灭，可实现 nmol 级的 Hg2 +检测。原位生成的络合物可通过紫外-可见光谱变化实现对Cl-的识别，检测限可达 μmol 级。

　　随后，他们[43]又利用含有芘荧光团的荧光分子探针 26 实现了 Hg2 +和 Cl-的接力识别。26 在水溶液中与 Hg2 +结合后，引发了芘 excimer 的形成，在 460nm 处出现新的宽发射峰，证明探针 26对 Hg2 +具有良好的选择性，使得 26 在水溶液中可比率识别 Hg2 +,检测限为 0. 2μmol/L.原位生成 26-Hg2 +络合物与 Cl-结合后，在 375nm 处及392nm 处荧光增强。

　　2014 年，Chattopadhyay 等[44]设计合成了一种识别 Hg2 +的探针 27.27 在水溶液（ pH =7. 4）中对 Hg2 +具有高度选择性，只是达到平衡的响应时间稍长（ 1h） .结合 Hg2 +后（ 330nm 激发） ,通过荧光共振能量转移机制（ FRET） 导致 575nm 处的荧光增强，喹啉荧光团在 440nm 的荧光减弱，检测限低至 0. 45μmol/L.进一步研究表明，所得的27-Hg2 +络合物与 S2 -作用后能释放出探针27,其荧光信号得到恢复。

　　2014 年，Fang 等[45]使用探针 28 首次实现基于 J-聚集及解聚的机制识别 Hg2 +和 Cys.探针28 与 Hg2 +结合后发生 J-聚集引起荧光猝灭。原位生成的 28-Hg2 +聚集体与 Cys 作用后，Hg2 +被Cys 夺出，28 的荧光信号得到恢复。探针 28 对Hg2 +和 Cys 检测限分别为 36. 6 和 91. 3nmol/L.

　　1. 4 其他金属离子-阴离子的接力识别

    除了前述的几种报道较多的 Zn2 +、Cu2 +、Hg2 +几种重要的金属离子与阴离子的接力识别外，近年来还出现了许多其他金属离子与阴离子的接力识别报道，如 Al3 +和 HSO4-[46]、Al3 +和ClO4-[47]、Al3 +和 F-[48]、Fe3 +和 Cys[49]、Fe3 +和F-[50]、Cd2 +和 H2S[51]、La3 +和 F-[52]、Cr3 +和HSO4-、F-[53]以及 Ag+和 I-[54]的接力识别。

　　2 阴离子和金属离子的接力识别

　　2010 年 Yin 等[55]报道了一种色烯衍生物 29对 Cys 和 Hg2 +的 接 力 识 别。29 在 Tris-HCl（ 10mmol/L,pH =8. 0） 缓冲液中于 550nm 处具有强荧光发射，与 Cys 作用后发生开环反应得到产物 30,荧光发生猝灭。向原位生成的产物 30 中加入 Hg2 +后，可引起脱硫及分子内迈克尔加成两个连续反应，重新生成 29,使其荧光信号得以恢复。

　　2012 年 Peng 等[56]利用探针 31 首次实现了基于荧光“开-关-开”机制的 F-和 Cu2 +的接力识别。探针 31 对 F-具有高选择性、高灵敏度的识别作用。由于 F-对硅原子具有很强的亲和力，能将酚羟基上的 TBS 保护基团脱去，所得的酚氧负离子进而发生对氰基的加成反应得到环化产物32,这一过程使得 31 在乙醇 /水（ 1 ∶ 1） 溶液中的荧光发射急剧增强，溶液颜色由黄变绿。31 与F-作用后，在乙醇溶液中荧光增强 833 倍； 在水溶液中荧光增强 164 倍。现场生成的环化产物32 可选择性识别 Cu2 +,与 Cu2 +结合后其荧光迅速猝灭，二者的结合比为 1∶ 1.

　　2013 年，Bhalla 等[57]利用五苯醌骨架合成了探针 33,其在 DMSO 溶液中与 F-作用后发生酰胺的去质子化，造成其荧光猝灭。原位生成的去质子化产物可通过荧光增强识别 Cu2 +.这种对F-和 Cu2 +具有接力识别功能的荧光探针尚不多见。

　　最近 Yin 等[58]巧妙地使用一种商品化的有机颜料中间体 3,4,9,10-苝四甲酸二酐（ 34） 成功实现了 HS-和 Hg2 +的接力识别。在水/二甲基亚砜（ 1/1,pH = 7. 4） 溶液中，34 可高选择性识别HS-,在 499nm 处引起显著的荧光增强。这是由于 HS-先对酸酐发生亲核进攻导致 34 发生水解开环并发生取代反应生成相应的硫羟酸而引起的。所生成的产物能通过荧光猝灭接力识别Hg2 +,这是由于 Hg2 +与硫的强亲和性，硫羟酸产物发生了脱硫及环化反应重新生成了 34.

　　3 金属离子和金属离子的接力识别

　　利用两种金属离子与探针分子的结合常数差异而进行的金属离子间置换是较早出现的接力识别，但是这种金属离子间置换过程容易导致竞争离子间相互干扰的缺陷。

　　2006 年，Yang 等[59]设计合成了荧光探针增强，结合比为 1∶ 1.原位生成的 39-Zn2 +络合物与 Cu2 +作用后荧光猝灭，这表明 39-Zn2 +可以通过金属离子置换识别 Cu2 +.这种荧光信号“关-开-关”形式的接力识别，为使用弱荧光强度的分子探针识别对荧光具有猝灭作用的金属离子提供了一个较为简便的方法。

　　4 阴离子和阴离子的接力识别两种离子的接力识别

    具有高度的挑战性，目前相关报道极少。2012 年，Wang 等[64]报道了一种具有两种特异性反应位点的探针 40,并用于接力识别 F-和 CN-,具有快速响应和独特的三重输出模式（ 荧光颜色、荧光强度和紫外吸收谱图） ,同时也实现了通过荧光及紫外吸收比率型识别 F-和 CN-.探针40 与 F-作用后，脱去2 个TBS 基团并发生分子内环化反应生成 41,荧光增强； 当 41 继续与 CN-反应时发生亲核取代反应生成产物 42,荧光继续增强。

　　5 结语

　　由于在实现荧光探针分子功能强化方面的独特优势，具有接力识别功能的荧光探针研究已经受到越来越多的关注。基于两种离子对探针分子的连续性专一型反应而设计的接力识别功能荧光探针目前仍然稀少，但已经引起了研究者的重视。在探针分子设计的源头上着重关注其连续使用的潜力，合成出具有接力识别功能的探针分子，对于减少合成工作量，实现节能减排都具有重要意义。

　　此外，通过预设接力识别的离子对于某些特定荧光响应机制的（ 如 ESIPT） 的调控，是实现比率荧光信号输出接力识别的有效方法。设计合成可在纯水介质中实现重要离子或分子的专一性接力识别的荧光探针，并应用于生命体系中的成像与示踪，将是未来接力识别研究工作中重点领域。可以预见，具有接力识别功能的荧光探针研究将会吸引越来越多的研究者的兴趣，在识别机制的综合运用、探针分子功能强化等方面将会有更广阔的应用前景。

　　参 考 文 献

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