耐热优化纤维素酶在大肠杆菌中的高效表达

　　纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生 物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖，有效地减少了污染。随着纤维素酶在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业和能源工业上的应用，它已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。大肠杆菌(Escherichia coli)具有繁殖迅速、培养简单、遗传背景清楚、基因克隆表达系统成熟完善等优点，是人们表达重组酶的第一选择。在大肠杆菌中表达外源基因受到的影响很多，比如表达载体的拷贝数和稳定性，翻译起始效率以及重组蛋白的稳定性。而翻译起始效率跟 mRNA5'起始端二级结构的稳定性以及稀有密码子的使用频率有着很大的关系。据报道，mRNA 翻译起始区域中的 SD 序列与翻译起始位点 ATG 之间的空间构象和翻译效率有很大关系。通过对大肠杆菌的各种编码基因分析，发现同义密码子的相对使用频率，即 RSCU(Relative synonymous codon usage) 的值不同。

　　热 纤 梭 菌 ( Clostridium thermocellum ATCC27405)是一种高温厌氧细菌，它的纤维素酶和半纤维素酶构成多酶复合体，纤维素酶主要是由内切β-1，4-葡聚糖酶 ( C1 酶)、外切 β-l，4-葡聚糖酶 ( Cx酶)和葡萄糖苷酶 3 种酶组成的。其中，内切 β-l，4-葡聚糖酶是分解纤维素最主要的酶。嗜热梭菌产生的纤维素酶耐热性好，但由于热纤梭菌是一种严格的厌氧菌，该菌的培养条件极其苛刻，其纤维素酶的分泌必须在高度厌氧的条件下进行，且菌株产酶量相对较低，不适合在工业中大规模发酵生产。而采用分子生物学手段，将嗜热酶基因导入大肠杆菌中高效表达，是一种非常有效的方法。

　　本研究将重组质粒 pHsh-celD 经过两步优化实现此纤维素酶在大肠杆菌 E． coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 中高效表达，构建高酶活、耐热和产酶条件要求低的纤维素酶基因工程菌，为该酶在工业上的开发及利用提供基础资料。

　　1 材料与方法

　　1． 1 材料
　　大肠杆菌 E． coli DH10B，E． coli BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL(购自 Promega 公司) 采用 Luria-Bertani(LB) 培养基:胰蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5g / L，NaCl 10 g / L。固体培养基添加终浓度为 2%的琼脂粉。

　　质粒 pHsh-celD 由本实验室构建并保存。该表达载体 pHsh 是由大肠杆菌 σ32因子调控，包括一个热激启动子和终止子，通过热激诱导外源基因表达。

　　1． 2 方法
　　1． 2． 1 基因操作 热纤梭菌基因组提取与 DNA 操作采用分子克隆技术标准方法进行。质粒转化采用电转化方法进行，质粒和 PCR 产物采用 Qiagen plas-mid kit 和 PCR purification kit(Qiagen USA)纯化。

　　1． 2． 2 重组表达质粒 pHsh-celD mRNA 二级结构的优化 对重组表达质粒 pHsh-celD 的翻译起始位点AUG 附近的 mRNA 二级结构的空间构象和 mRNA二级结构的自由能进行在线分析(form1-2． 3． cgi)，在不改变目的基因编码区氨基酸以及启动子序列的前提下，利用同义突变的方法，达到破坏 mRNA 的核糖体结合位点及翻译起始位点的茎环结构，提高mRNA 自由能的目的，得到具有最佳 mRNA 二级结构及自由能的质粒 pHsh-celD I。所分析的序列选择为从转录起始位点 ACC 开始至下游 70 个碱基，由于所使用的载体是温控型载体，外源基因表达的温度是 42 ℃，因此在软件设置中将 mRNA 形成的温度由默认的 37 ℃改成 42 ℃，其他设置为默认。

　　pHsh-celD 分析序列: 5'-ACCTGTTAACCGTCGA-CAAGAAGGAGATATACCCATGGAGGAGACCAAAGTGTCAGCTGCAAAAATAACG-3';pHsh-celD I 分析序列:5'-ACTTATTAATATTAGAAAAGAAGGAGATATACAAATG-GAGGAGACCAAAGTGTCAGCTGCAAAAATAACG-3'。以重组质粒 pHsh-celD 为模板，设计引物 P1 和 P2 进行定点突变，引物序列如下(加粗部分为突变位点)。P1:5'-AAGAAGGAGATATACAAATGGAGGAGACCAAAGTGT-C-3'; P2: 5'-TTCTAATATTAATAAGTCATTGGATCAT-GGGGATGTTTC -3';按 PrimeSTAR HS DNA polymerase常规PCR 方法扩增，反向PCR 反应体系为550μl，PCR反应条件: 98 ℃变性25 s;60 ℃退火30 s，72 ℃ 4 min30 s，循环20 次;72 ℃ 10 min。PCR 产物电泳检测正确后割胶回收 DNA 片段，经磷酸化后自身环化，将优化后表达质粒命名为 pHsh-celD I，并转化至 E． coliDH10B，挑取阳性克隆，提取质粒酶切验证。双酶切验证正确的质粒送上海美吉生物技术公司测序。

　　1． 2． 3 重组表达质粒 pHsh-celD I N 端密码子的优化对重组表达质粒 pHsh-celD I 的全部碱基在线密码子使用频率软件分析(http:/ /gcua． schoedl． de/)，在不改变目的基因编码区氨基酸的前提下，利用同义突变的方法，将 N 端的11 ～29 位氨基酸的密码子进行突变，将其突变成大肠杆菌的最优密码子。pHsh-celD I N 端碱基分析序列:5'-ATAACG-GAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTTATA-3'; 将 celD 的 N 端第 11 ～ 29位 氨 基 酸 的 密 码 子 进 行 突 变。以 重 组 质 粒pHsh-celD I为模板，设计引物 P3 和 P4 进行定点突变，优化表达质粒的 N 端密码子。引物序列如下(加粗部分为突变位点)。P3:5'-CGTATCCGTCTGAACTCTATCGGTTTCATCCCGAACCACAGCAAAAAGGCGACT-3';P4:5'-AGAGTCGAACTGGTAGTTTTCGGTGATTTTTGCAGCTGACACTTTGGTCTC -3'。

　　按 PrimeSTAR HS DNA polymerase 常规 PCR 方法扩增，反向 PCR 反应体系为 50 μl，PCR 反应条件: 98℃ 变性 25 s;60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 4 min 30 s，循环20 次;72 ℃ 10 min。PCR 产物电泳检测正确后割胶回收 DNA 片段，经磷酸化后自身环化，并转化至E． coli DH10B，挑取阳性克隆，提取质粒酶切验证。双酶切验证正确的质粒送上海美吉生物技术公司测序。

　　1． 2． 4 重组蛋白的表达与纯化 重组质粒 pHsh-celD，pHsh-celD I，pHsh-celD II 电转化到宿主细胞E． coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 中，挑取重组单菌落接种于含 100 μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 培养液中，30 ℃振荡培养至 OD600达到 0． 6 ～0. 8 时 转入42 ℃ 水浴摇床进行热激表达，继续培养 8 h 后离心收集菌体。用 50 mmol/L pH 7． 5 的 Tris-HCl 缓冲液洗涤细胞 2 次，并用相同缓冲液重悬细胞，置于冰水浴中用超声波仪破碎后，将细胞碎片于 12 000r / min 离心 10 min，去除上清液即为粗酶液。粗酶液在 60 ℃热处理 30 min 后，4 ℃、12 000 r/min 离心 30 min 去除变性蛋白。

　　1． 2． 5 纤维素酶酶活测定 羧甲基纤维素钠(CMC) 活性及纤维素酶活性测定方法参考文献［15］进行。纤维素酶活性单位定义为每分钟催化产生 1 μmol 还原糖的酶量。

　　2 结果与分析

　　2． 1 重组表达质粒 pHsh-celD 二级结构的优化
　　由图 1Ⅰ可知，重组载体 pHsh-celD 的 mRNA 二级结构在 SD 序列处形成了一个发卡结构，阻碍核糖体和 mRNA 区域的结合，从而影响了翻译起始的效率。分析区域的自由能是 －5. 22 cal/mol，可能形成稳定的二级结构，不利于基因的高效表达。在不改变目的基因翻译的氨基酸序列的前提下，尽可能使用同义密码子和改变无关碱基的方法尝试突变一些位点，设计了突变引物。以 pHsh-celD为模板，PCR 扩增出优化后的序列，再经过磷酸化连接得到新的重组载体 pHsh-celD I。将 pHsh-celD I的翻译起始区域的序列进行在线分析，得到其形成的 mRNA 空间构象，如图 1Ⅱ。由图可知，优化后重组载体的 mRNA 二级结构中，原来的发卡结构被彻底破坏，SD 序列和 AUG 均被释放到一个很大的环状结构中，核糖体能够毫无阻碍地与 mRNA 结合，开始重组蛋白的翻译。所分析区域的自由能也变为－ 4. 8 cal / mol，由于自由能的绝对值越小，所形成的mRNA 结构越不稳定，从而更利于翻译的顺利进行。【图.略】

　　2． 2 重组表达质粒 pHsh-celDⅠN 端密码子的优化
　　通过对大肠杆菌的各种编码基因分析，发现同义密码子的相对使用频率，即 RSCU 的值不同。大肠杆菌密码子的 RSCU≥1 为优势密码子，0． 05 ＜RSCU ＜ 1 即非优势密码子，RSCU≤0. 05 为稀有密码子。当翻译遇到稀有密码子时需要经过多次辨认才能找到正确的 tRNA，因此外源蛋白的合成就会在此处停顿，在含有较多的稀有密码子，或者相同的稀有密码子连续出现时，会发生明显停顿，抑制蛋白合成，有时甚至会发生密码子的错配。其中 AGA、AGG、CGA、CGG 编码的精氨酸( Arg)、AUA 编码的异亮氨酸(Ile)和 CCC 编码的脯氨酸(Pro)是极端稀有密码子，对外源基因的表达抑制作用更大。

　　对重组表达质粒 pHsh-celD I 全部编码框基因的密码子使用频率进行在线分析 (http:/ /gcua．schoedl． de / ) ，celD I 的 N 端从第 11 位氨基酸就遇到了异亮氨酸(Ile)的极端稀有密码子 AUA，第 20位氨基酸遇到了精氨酸(Arg) 的极端稀有密码子CGA，这 2 个极端稀有密码子对外源基因的表达存在抑制作用。同时从第 11 位氨基酸到第 29 位氨基酸其他的密码子也非优势密码子。原始序列为:5'-ATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTTATA-3' ( 图 2a )。 在不改变目的基因翻译的氨基酸序列的前提下，尽可能地改用大肠杆菌的同义密码子，尝试突变一些位点，突变 后 序 列 为: 5'-ATCACCGAAAACTACCAGT-TCGACTCTCGTATCCGTCTGAACTCTATCGGTTTCATC-3'(图 2b)，突变为大肠杆菌的优势密码子。由于这一段区域比较集中，所以一次性设计突变引物，以pHsh-celD I 为模板，PCR 扩增出优化后的序列，再经过磷酸化连接得到新的重组载体 pHsh-celD II。【图.略】
　　
　　2． 3 重组纤维素酶的表达及检测
　　为检测优化 mRNA 二级结构和优化 N 端密码子 的 效 果，分 别 以 pHsh-celD、pHsh-celD I 和pHsh-celD II 转化大肠杆菌 E． coli BL21 -Codon-Plus(DE3)-RIL，热激诱导 6 h 后收集菌体。以pHsh 转化产物为对照，SDS-PAGE 分析结果 ( 图3) 表明，重组菌均能产生约分子量为66 000 的特异条带，与预期的蛋白相对分子量大小一致;含质粒 pHsh-celD 的重组菌中蛋白表达量较低，含质粒 pHsh-celD I 的重组菌中蛋白表达量提高，含质粒 pHsh-celD II 的重组菌中蛋白表达量显着提高。这说明对重组质粒 mRNA 二级结构及 N 端密码子的优化取得了预期的效果，目的蛋白的表达量得到很大提高。
　　
　　2． 4 重组纤维素酶的酶活检测
　　含 pHsh-celD、pHsh-celD I、pHsh-celD II 的大肠杆菌菌液最高酶活分别达到 (4．1 ± 0.3) U/ml、(5． 8 ± 0. 3)U / ml、(6． 4 ± 0. 4)U / ml。重组菌 pHsh-celD II 的酶活是最初的重组菌 pHsh-celD 的 1. 6 倍。这与 SDS-PAGE 检测到的蛋白表达结果完全一致。

　　3 讨 论

　　为了在大肠杆菌细胞中合成某种特殊的外源酶，以满足工业化的要求，仅仅停留在检测水平的表达是远远不够的，必须设法提高表达量。就目前所知，有许多因素如启动子的强度、DNA 转录起始序列、密码子的偏好性、mRNA 二级结构、信号肽的结构、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和宿主细胞的生理特征等，都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率。本研究主要讨论外源基因本身的特征以及由此决定的表达水平，即密码子使用频率、mRNA 可能形成的二级结构的问题。

　　影响外源基因表达的重要因素之一是翻译起始效率。在本研究中，分析区域的自由能是 － 5. 22cal / mol，可能形成稳定的二级结构，不利于基因的高效表达，由此我们进行了第一次优化。优化后分析区域的自由能变为 － 4. 8 cal/mol，由于自由能的绝对值越小，所形成的 mRNA 的结构越不稳定，从而更利于翻译的顺利进行。

　　本研究将重组质粒 pHsh-celD 的 mRNA 二级结构和 N 端密码子进行了两步优化最终实现了该酶的高效表达。我们所采用的热激载体 pHsh 作为表达载体是由大肠杆菌σ32因子调控，包括一个热激启动子和终止子，通过热激就可以高效地表达外源基因，所以在诱导外源基因表达过程中就不需要加入化学诱导剂。而化学诱导剂如 IPTG 比较昂贵，是基因工程菌株在工业化应用中的一个瓶颈，而热激诱导能很好地减少基因诱导表达时的成本，这无疑在工业化应用中具有巨大的优越性和现实意义。

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