双黄益骨方对糖尿病合并骨质代谢的作用靶点和影响途径

　　糖尿病合并骨质疏松症(diabetic osteoporosis,DOP)是指由于糖尿病导致骨代谢异常,发生骨含量减少,骨密度降低,骨质疏松而出现系列临床症状.

　　临床上除了有糖尿病原有的表现外,还可表现为腰腿痛、活动功能障碍、身长缩短及驼背、易发生抽搐与骨折等.西医抗骨质疏松治疗药物具有一定的副作用,因此,糖尿病骨质疏松的中医药治疗具有天然无毒无副作用的特点,且临床以补肾壮骨活血为基础,能取得明显的临床疗效.本研究通过代谢组学研究寻找中药对人体骨代谢的作用靶点和影响途径,现报告如下.

　　1资料与方法

　　1.1 诊断标准 符合世界卫生组织1999年提出的糖尿病诊断标准,先确诊糖尿病,再符合《原发性骨质疏松症诊治指南2011》低骨量或骨质疏松的诊断[1].

　　1.2 纳入标准 女性:年龄20-50岁,男性:年龄20-60岁;近8周内未用钙片等西药治疗骨质疏松;符合诊断标准.

　　1.3 排除标准 绝经女性或原发性骨质疏松症患者;因服用激素导致或其他内分泌疾病导致的继发性骨质疏松症者;体检有严重心、脑、肝、肾疾病;妇女有卵巢切除史;不能坚持慢病门诊管理随访和配合研究者;病情加重或变化,需要采取其他积极治疗措施.

　　1.4 一般资料 糖尿病合并骨质代谢异常患者18例.男11例(38.9%),女7例(61.1%).平均年龄(46.6±5.0)岁.中药治疗3个月成为治疗组.在中药治疗期间,有1人中断中药治疗,2人不愿抽血复查.

　　1.5 治疗方法 双黄益骨方:来源于广东省名老中医熊曼琪教授的经验方,由龙骨、杜仲、熟地等组成.药材由广州中医药大学第二附属医院药剂科购自广东省中药材公司.患者连续服用3个月中药.

　　1.6 观察指标1.6.1 样品预处理 1H-NMR谱采样前,将所有血清样本解冻,在4 ℃下,10000 g离心10 min.取300 μL上层血清加至5 mm NMR测试管中,后加入0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(0.2mol/L NaH2PO4,pH =7.4)200 μL和重水50 μL,振荡混匀备用.

　　1.6.2 NMR实验 血浆测定使用Bruker AVANCEIII 500 MHz超低温探头核磁共振仪,调用Carr-Pur-cell-Mei boom-Gil(lrecycle delay-90°-(τ-180°-τ)n-acquisition)脉冲序列.NMR测定相关参数如下:回波时间1 ms,谱宽10000 Hz,采样点数64 k,叠加次数128次,循环次数64次,控制温度在298 K.自由感应衰减(free induction decay,FID)信号经过32k傅立叶变换转为NMR谱图,并导入MestReNova 2.0,以乳酸峰(δ1.33)为化学位移参考峰的位置,对图谱进行相位校正和基线校正并对所有的1H CPMG谱进行自动积分,积分区间δ0.5-9.0,积分间隔0.005 ppm.为了消除剩余水峰引起的影响,将积分区间δ4.7-5.1的积分值设为零.

　　1.7 数据预处理 将归一化后的数值导入SIMCA-P+12.0 软件(Umetrics,Sweden)进行 PCA,PLS -DA,OPLS-DA的模式识别分析.R2和Q2作为模型验证的主要参数,其中R2是所解释的模型差异,Q2是所预测的模型差异.因此,当R2和Q2数值越接近1就说明模型的拟合准确性越好.通常情况下,R2、Q2高于0.5(50%)则认为该模型较好.模式识别的分析结果采用得分图(Score plot)和载荷图(Loading plot)的形式表示.

　　对于处于相同病理生理状态的样品,所得到的样本通常具有相似的组分,因此在图中也应处于相似的位置,距离对照组越远,说明疾病诱导的生化代谢偏离正常状态越严重.而载荷图则反映各积分段对样本主成分得分值的贡献大小,载荷图上每一个点代表了样本中检测到的组分的有关信息,距离原点越远,则其对各组间的分类贡献越大.若样品在OPLS-DA中可以在一维中进行完全的区分,就可以将载荷图中的相关数据导入Matlab中建立代谢物的correla-tion coefficient-loading相关图,从而找出对组间差异具有显着性贡献的代谢物.

　　2结 果

　　2.1 治疗组与糖尿病并骨代谢异常代谢组的1H-NMR图谱 经治疗后治疗组血液样品中的瓜氨酸、缬氨酸、甜菜碱、谷氨酰胺、O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白、丙酮酸、三羧酸循环产物(α-酮戊二酸,柠檬酸)的水平上升,而支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸)、醋酸盐、葡萄糖、丙氨酸的水平则下降.为了具体的分析治疗后患者代谢物的变化情况,进一步进行模式识别分析.(见图1)

　　其中:1.亮氨酸;2.缬氨酸;3.异亮氨酸;4.丙氨酸;5.N-乙酰糖蛋白;6.0-乙酰糖蛋白;7丙酮酸;8.α-酮戊二酸;9.柠檬酸;10.肌酸;11.胆碱;12.甜菜碱;13.脯氨酸;14.葡萄糖;15.瓜氨酸;16.谷氨酰胺;17.1-甲基组氨酸;18.酪氨酸;化学位移区间δ0.5-2.0和δ6.2-9.2分别放大8倍和4倍.

　　2.2 治疗组与糖尿病并骨代谢异常代谢组产物谱的PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析 治疗前后的PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析结果见图2.在PCA分析中(见图2A),治疗前后两组基本分开,但也存在部分.为了得到更加显着的样本分组和良好的分析模型,进一步对该数据进行PLS-DA(见图2B)和OPLS-DA(见图2C)分析.OPLS-DA分析结果中,各样本分组明显优于PCA的结果,两个剂量组能进行较好的区分.（图2略）

　　根据OPLS-DA中得分图的结果可以建立相应的相关图,在相关图中峰信号值在基线以上的代表该代谢物在给予治疗后组中含量是增加的,反之,在基线以下则是代表含量下降.在本研究中,治疗前组有18例样品,治疗后组有15例样品,其样品数共33,故当代谢物相关系数的绝对值大于0.417,认为其差异具有统计学意义(P<0.05).两组之间的血浆中小分子差异代谢物的变化情况详见图3和表1.从表1可以看到与糖尿病并骨代谢异常相比血液中的瓜氨酸、缬氨酸、甜菜碱、胆碱、脯氨酸、谷氨酰胺、O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白、丙酮酸、1-甲基组氨酸、三羧酸循环产物(α-酮戊二酸,柠檬酸)的水平上升,而支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸)、葡萄糖、酪氨酸、丙氨酸的水平则下降.

　　3讨 论

　　祖国医学认为,肾藏精、精生髓,骨赖于髓,骨髓充盈,骨骼生长旺盛,骨性坚固,肢体活动有力.糖尿病骨质疏松症的基本病机是以肾虚、脾虚、肝肾不足为病之本,尤以肾虚髓空为关键,血瘀、湿浊、寒湿为病之标,其病位在骨与关节,与肝脾肾三脏相关[2].双黄益骨方具有益气养阴、脾肾双补、填精壮骨活血之功,前期大量研究也验证其对骨质疏松症有着较好临床疗效,具有改善骨小梁结构的作用,可通过调控骨蛋白防治骨质疏松[3-6].本研究从代谢组学角度,揭示双黄益骨方改善糖尿病骨质疏松症患者能量代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢的紊乱.

　　3.1 双黄益骨方改善糖尿病骨质疏松症患者能量代谢 经治疗后患者血清中柠檬酸、α-酮戊二酸含量上升,血糖水平较前控制,提示双黄益骨方改善糖尿病骨质疏松症患者线粒体代谢紊乱,改善骨细胞的能量代谢.谷氨酰胺是体内含量最丰富的非必需氨基酸,约占总游离氨基酸的50%,在结缔组织细胞提供能量,在软骨细胞合成胶原时提供氨基.一方面,其增加力量,提高耐力,运动期间,机体酸性代谢产物的增加使体液酸化.另一方面,谷氨酰胺通过催化肽键中谷氨酰残基的γ-羧酰胺基和多肽链中赖氨酸的ε-氨基之间的共价结合,使蛋白质分子形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异肽键或聚胺与组胺共价结合,合成转谷氨酰胺酶(TG).后者诱导刺激能使TG转染的Swiss 3T3成纤维细胞中胶原及纤连蛋白沉积增加,而抑制TG的活性则会导致胶原的表达及沉积减少.破骨细胞中也发现了TG对胶原表达和沉积相似的影响[7].TG能够通过胞外水解ATP提高组织局部磷酸盐的浓度,影响磷酸盐代谢[8].经治疗后患者血清谷氨酰胺水平较前提升,提示肌肉间的能量代谢有所改善,促进软骨细胞合成胶原,影响磷酸盐代谢[9].

　　3.2 双黄益骨方改善糖尿病骨质疏松症患者氨基酸代谢异常 经治疗后患者血清中氨基酸代谢紊乱较前好转,表现:(1)血清中O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白水平上升,提示双黄益骨方可以纠正骨代谢信号调节紊乱;(2)血清中脯氨酸水平上升,患者的骨合成原料增加,促进骨合成,这与中医学"肾主骨,生髓"的理论相符,提示使用补肾中药患者可以生髓,增加骨量;(3)血清中的支链氨基酸(亮氨酸和异亮氨酸)、丙氨酸水平下降,1-甲基组氨酸水平上升.它们是肌肉间的供能剂和在蛋白质合成中提供氨基.上述改变提示双黄益骨方可以改善维持骨骼稳定周围的肌肉代谢,这与中医理论的"肝主筋,脾主肉"相符,通过补益肝肾,健脾之法,患者筋骨、维持骨骼稳定周围的肌肉较前恢复;(4)血清中酪氨酸水平下降,提示双黄益骨方可以改善患者酪氨酸的磷酸化,提高骨钙素水平,防治骨质疏松症.本研究发现患者经治疗后瓜氨酸水平上升.瓜氨酸是尿素循环中的中间产物,在其代谢过程中会生成L-精氨酸和副产物NO,而NO可以缓解血管压力,改善骨组织的微循环.L-精氨酸具有抗氧化作用,起到血管保护作用.用于辅助治疗L-精氨酸缺乏引起的相关疾病[10].莫纳德等[11]证实瓜氨酸能够改善营养缺乏状况,增加肌肉蛋白合成,维护关节运动的机能.

　　3.3 双黄益骨方改善糖尿病骨质疏松症患者脂代谢异常 经治疗后患者血清甜菜碱与胆碱的水平上升.甜菜碱主要在肝脏中发挥甲基供体的作用,减少了胆碱和蛋氨酸的供甲基消耗,改善脂代谢及胰岛素抵抗作用,预防脂肪肝.在机体供甲基不足时,通过提高BHMT活性,使高半胱氨酸接受甜菜碱的甲基,合成蛋氨酸.而高半胱氨酸血症常有严重的智力低下、癫痫、精神错乱、骨质疏松、晶状体易位、动脉粥样硬化和血栓栓塞等可导致威胁生命的一系列综合征.双黄益骨方通过提高甜菜碱水平可以有效降低半胱氨酸水平.

　　综上,以代谢组学作为核心技术,辅以生化分析和骨密度方法等,我们可以发现双黄益骨方可以从糖代谢、氨基酸代谢及脂肪代谢等方面治疗糖尿病骨质疏松症.

　　参考文献

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