黄喉拟水龟腐皮病的确切病因探究

　　黄喉拟水龟(Mauremys mutica)又称石龟、石金钱龟、黄板龟、香龟等,隶属于龟科(Emydidae)、拟水龟属(Mauremys),具有较高食用、药用及观赏价值,已被列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》.近年来,黄喉拟水龟野生资源日趋减少,人工养殖发展迅速,但水环境恶化及病害频发给养殖业带来严重经济损失.

　　腐皮病是黄喉拟水龟养殖过程中常见细菌性疾病之一[1-3],慢性感染导致黄喉拟水龟体表溃疡、腐烂等[4].关于黄喉拟水龟腐皮病的确切病因至今不明,目前尚未见文献报道.

　　2013年3月,江苏省徐州市某养殖场饲养的黄喉拟水龟发生腐皮病慢性感染,病龟临床症状主要表现为,头、颈、肢部皮肤溃烂,蜕皮、爪脱落,有腥臭味,严重感染导致死亡.本研究从黄喉拟水龟腐皮病灶进行细菌分离、生理生化试验、16SrDNA序列比对并构建系统发育树,最终鉴定为类香味菌属新种(Myroides sp.),对类香味菌的分离鉴定、动物感染和药敏试验等研究,以期为黄喉拟水龟腐皮病的诊断与防治提供参考.

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1试验用动物稚龟(平均体重8.0g,体长4.0cm)购自徐州市某花鸟市场,25 ℃饲养观察1周,确认健康无病后用于试验.

　　1.1.2 主要试剂 LB培养基、细菌生化鉴定管和药敏纸片,杭州微生物试剂有限公司产品;PCR反应试剂2×Taq PCR Master Mix,南京诺唯赞生物科技有限公司产品;细菌基因组DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,北京索莱宝科技有限公司产品;受体菌DH 5α由实验室保存;1kbDNA ladder(大小依次为:10 000、8 000、6 000、5 000、4 000、3 000、2 500、2 000、1 500、1 000、750、500、250bp)、pMD18-T克隆载体,宝生物工程(大连)有限公司产品.细菌通用引物F27:AGTTT-GATCATGGCTCAG,R1492:GTTACCTTGT-TACGACTT,M13F:CAGGAAACAGCTAT-GACC,M13R:TGTAAAACGACGGCCAGT,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1 病原菌分离纯化无菌生理盐水冲洗病龟体表病灶,无菌操作取病灶组织划线接种于LB培养基,29℃恒温培养24h.进一步挑取典型单菌落分离纯化,获得纯种后进行革兰染色镜检,并接种于试管斜面4℃保存备用.

　　1.2.2菌株鉴定

　　1.2.2.1形态学和生理生化鉴定无菌操作挑取适量分离菌接种于细菌生化鉴定管,29 ℃恒温培养48h,观 察 记 录 结 果.参 照 《伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手册》,对分离菌进行形态学和生理生化鉴定.

　　1.2.2.2分子鉴定参照胡秀彩等[6]方法进行,采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌基因组总DNA,10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,置-20℃保存备用.以总DNA为模板,采用细菌通用引物进行16SrDNA基因PCR扩增,PCR体系为2×TaqPCR Master Mix 12.5μL,上、下游引物各1μL,DNA模板1μL,ddH2O 9.5μL,PCR反应条件为:94℃4min;94℃40s,55℃40s,72℃1min,35个循环;72 ℃延伸10min.PCR产物与pMDl8-T载体连接,转化大肠埃希菌DH 5α,筛选阳性克隆,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.分离菌16SrDNA序列通过GenBank中的Blast进行相似序列检索,ClustalX 1.83软件进行序列比对分析,采 用MEGA 4软 件 邻 接 法 (Neighbor-joiningmethod)构建系统发育树,并用Bootstrap对进化树进行1 000次可信度分析.

　　1.2.3 动物感染试验分离菌接种于LB液体培养基29℃培养12h,取0.5mL菌液倍比稀释,其余菌液于4℃保存,用倾注平板法测定菌液浓度,无菌生理盐水稀释至10^8CFU/mL.稚龟感染试验采用腹腔注射法,每组6只稚龟,感染组每只稚龟注射0.1mL菌液,对照组注射等量无菌生理盐水,连续观察14d,记录试验结果.

　　1.2.4 药物敏感试验采用K-B法进行药敏试验,无菌操作将分离菌接种于LB平板,29℃培养24h,测量各药敏纸片抑菌圈直径,重复3次计算平均值.

　　2结果

　　2.1分离菌形态及培养特征

　　从黄喉拟水龟腐皮病体表病灶处分离获得1株细菌,编号为TSM13032;分离菌在LB培养基上生长良好,菌落呈淡黄色、半透明、表面光滑、湿润、边缘整齐;革兰染色阴性,短杆菌,两端钝圆(图1)

　　2.2菌株鉴定

　　2.2.1生理生化鉴定

　　选用35项细菌生化编码鉴定管对分离菌进行生化特性检测,结果如表1所示,TSM13032菌株为氧化型,不能利用葡萄糖产酸产气,MR试验、靛基质、脲酶、鸟氨酸脱羧酶和DNA酶试验均为阳性,硫化氢、V-P试验、苯丙氨酸脱氨酶、明胶液化等试验均为阴性.TSM13032菌株培养特性、生理生化特性,基本符合《伯杰氏细菌鉴定手册》类香味菌属(Myroides)细菌特征.

　　2.2.2 分子鉴定

　　以分离菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增其16SrDNA序列,电泳检测发现约在1 500 bp处 有 目 的 基 因 条 带,测 序 获 得TSM13032菌株16SrDNA片段大小为1 482bp(图2),序列递交至GenBank数据库获得登录号为KF611897.将16SrDNA序列通过Blast软件进行序列同源性检索,TSM13032菌株16SrDNA序列与人源类香味菌属新种(Myroides sp.)(登录号:JX966100)基因序列同源性最高达99.92%,与类香味菌属Myroides odoratus ATCC 4651T(登录号:M58777)、Myroides phaeus MY15(登 录 号:GU253339)、Myroides odoratimimus  CCUG39352T(登录号:AJ854059)参考菌株基因序列同源性分别为93.84%、96.22%和95.87%.进一步选择遗传距离较近的13个参考菌株构建系统发育树分析,结果显示TSM13032菌株与类香味菌属新种(Myroides sp.)(登录号:JX966100)亲缘关系最近,自然聚为一支(图3),并且类香味菌属(Myroides)菌株与黄杆菌属(Flavobacterium)亲缘关系较近;结合TSM13032菌株理化特征,最终鉴定为类香味菌属新种(Myroides sp.).

　　2.3动物感染试验结果

　　TSM13032菌株以10^8CFU/mL菌液腹腔注射稚龟,感染1d后出现精神委顿、行动迟缓、食欲减退等症状,3d后眼分泌物增多、呈局部腐皮等症状,观察14d后病龟无死亡现象,并且从体表病灶中重新分离获得类香味菌;对照组稚龟正常.

　　2.4药物敏感性

　　TSM13032菌株对24种抗生素进行药敏试验结果表明(表2),TSM13032菌株对替考拉宁、丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、乙基西梭霉素、红霉素、制霉菌素、四环素、利福平、克林霉素、呋喃妥因、复方新诺明,甲氧苄啶和洁霉素等14种抗生素耐药;对诺氟沙星中度敏感;对氨苄西林、哌拉西林、头孢哌酮、头孢噻吩、头孢孟多、阿奇霉素、萘啶酸、氯霉素和磺胺异恶唑等9种抗菌药物高度敏感.

　　3讨论

　　类香味菌(Myroides)为肠杆菌科类香味菌属细菌,广泛分布于水、土壤及动物和人粪便中,是引起严重感染的条件致病菌之一,主要引起人尿路感染和术后伤口感染[7-8].关于类香味菌感染黄喉拟水龟腐皮病病原的分离鉴定,目前尚未见文献报道.

　　类香味菌于1923年首次归为黄杆菌属(Flavobacte-ria),1996年将其重新归为类香味菌属(Myroides),包括气味类香味菌(M.odoratus)和拟气味类香味菌(M.odoratimimus)[9].近几年,相继得到3个类香味菌新种:海洋类香味菌(M.pelagicus)、深海类香味菌(M.profundi)、马里努斯类香味菌(M.ma-rinus)[10-12].本研究首次从黄喉拟水龟腐皮病体表中 分 离 获 得 类 香 味 菌 新 种 (Myroides sp.)TSM13032菌株,动物感染试验证实,TSM13032菌株可引起稚龟感染发病,不能导致稚龟死亡,这可能与该菌为条件致病菌有关.最近Maraki S等[7]首次报道动物咬伤引起类香味菌感染并导致严重发炎病例.

　　Ktari S等[8]从医院尿路感染患者尿液中分离获得拟气味类香味菌(M.odoratimimus).杜迅等[13]从软腐白菜根部土壤中分离病原菌,结合形态特征、生理生化特性确定为香味类香味菌.吴春笃等[14]为了解城市污水中病原菌污染状况,通过构建16SrDNA基因文库发现污水中存在类香味菌,认为类香味菌可能通过污水传播.国内外关于水生类香味菌分离鉴定及其感染致病机制,目前尚未见文献报道.

　　近年来,水产动物养殖过程中抗生素广泛使用导致细菌耐药性不断增强,增加了临床治疗难度.

　　研究表明,类香味菌产生染色体介导金属酶,因而对绝大多数碳青霉烯类、氨基糖苷类等抗生素天然耐受[15-16].本研究对类香味菌进行药物敏感试验,结果显示,1SM13032菌株对多种抗生素耐药,对氨苄西林、哌拉西林、头孢哌酮、头孢噻吩、头孢孟多等β-内酰胺类药物高度敏感.管福来等[16]从肺部感染病患痰液中分离获得类香味菌对哌拉西林、氯霉素、红霉素、磺胺异恶唑等药物敏感.

　　Maraki S等[7]研究表明,引起临床感染类香味菌对阿莫西林、氧氟沙星、氯霉素、磺胺异恶唑等高度敏感.Ktari S等[8]对医院感染类香味菌进行药敏试验显示对多种抗生素耐药,认为环丙沙星、利福平、磺胺异恶唑等是治疗类香味菌感染有效药物.本研究结果表明,哌拉西林、磺胺异恶唑、氯霉素等为候选药物,从而为类香味菌感染黄喉拟水龟腐皮病防治提供科学参考.

　　参考文献:

　　[1] 黎小正,韦信贤,童桂香,等.黄喉拟水龟摩氏摩根菌的分离鉴定及系统发育分析[J].上海海洋大学学报,2010,19(3):358-363.

　　[2] 黎小正,韦信贤,童桂香,等.黄喉拟水龟致病菌-松鼠葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验 [J].大连水产学院学报,2009,24(4):371-374.

　　[3] 谭爱萍,邹为民,姜兰,等.黄喉拟水龟体表溃疡病原菌SG24的分类鉴定[J].广东海洋大学学报,2007,27(3):64-68.

　　[4] 赵春光.龟鳖腐皮病的发生原因与有效预防[J].科学种养,2009(4):47.

　　[5]Brenner D J,Krieg N R,Staley J T.Bergey's manual of sys-tematic bacteriology(Second edition,Vol.2)[M].New York:Springer,2004:105-245.

　　[6] 胡秀彩,边延峰,赵腊梅,等.鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定[J].动物医学进展,2013,34(12):232-235.

　　[7]Maraki S,Sarchianaki E,Barbagadakis S.Myroides odoratimi-mus soft tissue infection in an immunocompetent child followingapig bite:case report and literature review[J].The Brazi J In-fect Dis,2012,16(4):390-392.

　　[8]Ktari S,Mnif B,Koubaa M,et al.Nosocomial outbreak of My-roides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospi-tal[J].J Hospital Infect,2012,80(1):77-81.

　　[9]Vancanneyt M,Segers P,Torck U,et al.Reclassification ofFlavobacterium odoratum(Stutzer 1929)strains to a new ge-nus,Myroides,as Myroides odoratus comb.nov.and My-roides odoratimimus sp.Nov[J].Int Union of Microbiol Soc,1996,46(4):926-932.