中华鳖腐皮病的病原的分离鉴定和药敏试验

　　中华鳖是浙江省四大水产养殖主导品种之一，据统计，2012 年全省鳖养殖产量达到 15. 5 万 t。但随着中华鳖养殖的快速发展和集约化程度的不断提高，浙江省中华鳖发病日趋增多，给养殖业带来巨大的经济损失。腐皮病是中华鳖养殖过程中的主要病害之一，发病范围广，持续时间长，对浙江省中华鳖养殖产业造成了严重的损失。本文对浙江省中华鳖腐皮病的病原进行了初步分离鉴定和药敏试验。

　　1 材料与方法

　　1． 1 材料和仪器

　　病鳖取自浙江某养殖场，活力差，反应迟钝，四肢、颈部、背甲及裙边均有皮肤发生糜烂，解剖可见肝脏和胆囊肿大，肠道充血，肠腔无食物。

　　健康鳖取自浙江萧山某养殖场。

　　VITEK32 全自动细菌鉴定仪、GNI+卡和GNS506 药敏试验卡购自法国生物梅里埃公司( bioMérieux) ; 药敏纸片( 直径 6 mm) 购自杭州微生物试剂有限公司; 培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

　　1． 2 病原菌分离

　　取症状典型的病鳖，无菌条件下从病鳖肝、肾、脾等组织取样，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28℃恒温培养24 h 后，挑取形态特征一致的优势菌落进行克隆培养，共分离到 040908-1 和040908-2 两株细菌，转接斜面培养基保存备用。

　　1． 3 人工感染试验

　　试验采用 60 cm × 50 cm × 40 cm 的塑料箱，每箱放养体重 50 ～ 80 g 的健康中华鳖 10 只，水温保持 25℃左右，连续充气，暂养 2 d 后进行感染试验。试验菌株培养 18 ～24 h 后，以无菌生理盐水制成菌悬液，菌悬液含菌量按 McF 浊度管结合活菌计数方法确定，菌株040908-1 为7. 5 ×108cfu·mL－ 1，菌株 040908-2 为 8. 2 ×108cfu·mL－ 1。

　　将 2 株菌的菌悬液作系列稀释( 原液、10 倍稀释液、100 倍稀释液) 后，以从右后肢注射( 0. 2 mL·只－ 1) 的方法分别进行人工感染试验。对照组注射等量无菌生理盐水。感染组与对照组均设立两个平行组。

　　1． 4 病原菌鉴定

　　按照常见细菌系统鉴定手册［1］、伯杰细菌鉴定手册( 第九版)［2］的方法进行细菌学鉴定，同时采用 VITEK32 全自动细菌鉴定仪的 GNI+卡进行比较鉴定。

　　1． 5 药敏试验
　　
　　在普通营养琼脂培养基上以纸片法测定病原菌对不同药物的敏感性，经 28℃ 恒温培养24 h，观察抑菌圈的有无并用游标卡尺测量其直径，抑菌圈越大，则病原菌对该种药物越敏感［3］。同时采用 VITEK32 全自动细菌鉴定仪的药敏试验卡进行 MIC 测定。

　　2 结果

　　2． 1 病原菌的分离

　　病鳖的肝、脾、肾划线样品于 28℃恒温培养24 h 后，所有营养琼脂表面均出现两种不同形态的优势菌: 一种菌落圆形，直径约 1. 2 mm，略隆起，光滑湿润，呈现一定的迁徙扩散生长现象，分离纯化后，编号为 040908-1; 另一种菌落直径 1. 8 mm 左右，圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，无迁徙扩散生长现象，分离纯化后，编号为040908-2。

　　2． 2 人工感染试验结果

　　健康鳖经菌株 040908-1，040908-2 人工感染，2 d 后陆续发病，发病率为 100%; 4 d 后病势加重并出现死亡，7 d 内死亡情况详见表 1( 两个平行组结果一致) 。经 2 株菌人工感染的病鳖，四肢、颈部、背甲边缘等处皮肤均出现不同程度的溃烂，与自然发病鳖的症状基本一致。从感染死亡鳖分离细菌作鉴定，结果与试验菌株完全相同。将第二次分离菌株继续做人工感染，结果与第一次人工感染类似。试验期间对照组鳖健康活泼，无任何症状。由此证明菌株 040908-1、040908-2 均为中华鳖腐皮病的致病菌。【1】

　　
　　2． 3 病原菌鉴定结果

　　两株病原菌的生理生化鉴定结果如表 2 所示。菌株 040908-1 为杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，具有运动性，氧化酶阴性，触酶阴性，生理生化反应与文献所述普通变形杆菌基本一致［1 －2，4 －5］。

　　菌株 040908-2 杆状，革兰氏阴性，氧化酶阳性，生理生化反应与文献所述维罗纳气单胞菌基本一致［1 －2，6 －7］。

　　根据全自动细菌鉴定仪 VITEK-32 的鉴定结果( 表3) ，菌株040908-1 的生物编码为6012140120，属于普通变形杆菌( 概率为 99%) 。菌株 040908-2的生物编码为 7000300064，属于维罗纳气单胞菌温和生物变种( 概率为 90%) 。结果与生理生化鉴定结果基本一致。

　　综合上述结果，可以把菌株 040908-1 和040908-2 分别鉴定为普通变形杆菌 Proteus vul-garis 和维罗纳气单胞菌温和生物变种 Aeromonasveronii biovar sobria。

　　2． 4 药敏试验结果

　　用纸片法测定了 2 株细菌对 27 种药物的敏感性( 表 4) 。妥布霉素、新霉素、奥复星、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素 6 种药物对 2 株细菌均有较强的抑制作用，氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素对菌株 040908-1 有 显 着 抑 制 作 用 但 对040908-2 无抑制作用或仅有微弱抑制作用，而复方新诺明仅对 040908-2 有抑制作用。【2】

　　
　　同时采用 VITEK GNS-506 卡对分离菌株进行了药敏检测，仪器根据美国临床实验室标准委员会( NCCLS) 的药敏标准自动判定敏感性，结果见表 5。其中 040908-1 对复方新诺明有耐药性而 040908-2 敏感，2 株菌均对庆大霉素敏感，与纸片法结果相同。【3】

　　
　　3 讨论

　　近年来，关于中华鳖腐皮病的病原菌已有较多研究，已经分离到的病原菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠产气单胞菌、温和气单胞菌、假单胞菌及无色杆菌等多种细菌［8 －10］。本研究从患腐皮病的中华鳖体内分离到的普通变形杆菌和维罗纳气单胞菌温和生物变种 2 种菌，人工感染均能够引起健康中华鳖发病与死亡，症状与自然发病类似，并能从病死鳖体内重新分离回收到原感染菌，证实这两种菌也都是中华鳖腐皮病的病原菌。

　　普通变形杆菌能够引起赤点石斑鱼溃疡病［5］和对虾红腿病［11］，同时也是鳖穿孔病的主要病原之一［4，12］，还能引起人类食物中毒［13］。维罗纳气单胞菌温和生物变种可引起中华鳖“拟白斑病”［7］，还是彩虹鲷、丁鱥以及幼体斑马贝的病原菌［14 －16］，还可以引起人类腹泻及其它感染［17］。

　　但还未见有这 2 株菌引起中华鳖腐皮病的报道。

　　这 2 株菌作为人类与水生生物的共同病原菌，应引起医学界和水产界的共同重视。

　　根据药敏试验结果，妥布霉素、新霉素、奥复星、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素 6 种药物对 2株病原菌均有较好的抑菌效果，可用于中华鳖腐皮病的防治，但在使用时要严格按照国标渔药使用准则进行。考虑到抗生素的大量使用，易使病原菌产生抗药性和造成水产品药物残留，应深入探讨药物之外的其他治疗方法。

　　鉴于普通变形菌和维罗纳气单胞菌生物变种广泛存在于自然水域中，都是条件致病菌，其致病性取决于宿主的健康状况、环境条件等，推测很可能是由于受伤或者环境胁迫等导致鳖体抗病力下降，病原菌乘机侵入造成发病。因此对该病的控制应以预防为主，加强管理，强化营养，提高鳖体抗病能力，避免鳖体受伤以及养殖环境恶化。

　　到目前为止，中华鳖的病害多根据症状命名，如腐皮病、穿孔病、白点病等［8，18］。但事实上某些症状之间可以相互转化，如腐皮病可以进一步发展成溃疡、穿孔病等; 而同一症状也有可能由不同细菌引起的，如已报道有多种细菌可以引起腐皮病［8］。

　　在本研究中，从病鳖体内分离到 2 株不同的病原菌，且都能导致健康鳖出现同样的症状，但 2株菌对于药物的敏感程度却有很大不同，复方新诺明对菌株 040908-2 有明显抑制作用，但对菌株040908-1 却毫无作用; 而链霉素、四环素对 2 株菌的作用效果却刚好相反。鉴于不同病原菌可以导致鳖出现相同症状，且不同病原菌对于同一种药物的敏感程度存在较大差异，如果没有确定病原而光凭症状来用药，很容易引起误用，不但达不到治病的目的，还可能延误病情，造成更大的损失。因此，有必要对中华鳖病害的命名重新加以梳理和规范。

　　参考文献:

　　［1］ 东秀珠，蔡妙英． 常见细菌系统鉴定手册［M］． 北京: 科学出版社，2001．
　　［2］ Krieg NR，Hoit JG． Bergey's manual of systematic bacteriology［M］． 9th edition． Williamsand Wilkins Company，Baltimore，1984: 516 － 548．
　　［3］ 曾令兵． 水产抗菌药物抗菌作用的测定方法［J］． 水产科技情报，1997，24( 1) : 23 －24．
　　［4］ 孙佩芳，蔡完其，吴建农，等． 鳖穿孔病的病原研究［J］． 水产学报，1996，20( 2) : 120 －124．
　　［5］ 杨霞，吴信忠． 赤点石斑鱼的普通变形菌病原学研究［J］．水产科学，2005，24( 9) : 5 －7．
　　［6］ 李本旺，李春枝，张邦杰，等． 中华鳖口咽腔溃烂综合症病原的研究［J］． 水产科技情报，2000，27( 5) : 210 －213．