乳酸恩诺沙星对温和气单胞菌的体外药用效果研究

　　温和气单胞菌(A.sobria)是我国淡水和海水水产品的一种常见致病菌,可以引起多种水产养殖动物感染发病,可单独引发感染或与嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)及其他病原菌混合感染,具有发病率高、传染性强、死亡快的特点。有报道该菌可导致罗非鱼(Tilapia)的出血性败血病,中华鳖(Trionyx sinensis)的肝水肿病,鲤((Cyprinus carpio)的体表溃烂病,幼鳖的白点病[1]等。另外,此菌可以通过病鱼经消化道感染人类,导致人类食物中毒,造成腹泻、败血症等疾病[2],属于人兽鱼共染的病原细菌。

　　恩诺沙星(enrofloxacin)是第一个畜禽专用的氟喹诺酮类广谱抗菌药物[3]。广泛应用于包括水生动物在内的各种动物细菌性疾病的预防和治疗,几乎对水生动物所有病原菌均具有较强的抗菌活性,对赤鳍病、烂尾病、烂鳃病、肠炎病等水产类动物疾病具有良好的疗效[4]。乳酸恩诺沙星为恩诺沙星的乳酸盐,其水溶性好于盐酸恩诺沙星,口服吸收快,体内分布广,对革兰阴性菌有很强的杀灭作用,对革兰阳性菌也有良好的抗菌作用。为了解乳酸恩诺沙星的体外抗菌活性,达到有效的控制鱼类细菌性疾病,本研究选择鱼类病原菌A.sobria,测定了乳酸恩诺沙星对A.sobria的最小抑菌浓度(minimal inhib-itory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(minimumbactericidal concentration,MBC)和 抗 菌 后 效 应(post antibiotic effect,PAE),以期为指导生产上科学使用氟喹诺酮类药物提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1试验菌株供试A.sobria由河南师范大学水产学院水产动物医学研究室提供,分离自患病斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)。

　　1.1.2试验药品供试药品乳酸恩诺沙星(含量98%)为浙江朗博药业有限公司产品;试验所用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、琼脂粉等为北京奥博星公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1乳 酸 恩 诺 沙 星 母 液 的 制 备精 密 称 取20.0mg乳酸恩诺沙星,加入少量0.1mol/L NaOH溶液,待 完 全 溶 解 后,加 水 定 容 至10 mL,即 为2 000μg/mL的母液,经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后分装,使用前配制。

　　1.2.2培养基的配制TSB培养基的配制方法:称取胰蛋白胨15.0g,大豆蛋白胨5.0g,氯化钠5.0g,加适量水后,调节pH至7.2,加水定容至1 000mL,121℃高压灭菌20min;TSA培养基则是在TSB培养基中加入15g/L的琼脂粉配制而成。

　　1.2.3细菌培养将保存的A.sobria菌种进行活化,取10μL菌液接种到1 000μL的TSB培养基中,28 ℃摇床培养过夜后,划线接种于TSA培养基,28 ℃培 养24h。挑 取 典 型 的 单 菌 落 接 种 于1 000μL TSB培养基,28 ℃培养12h后转接到100mL TSB培养基扩大培养,调整菌液浓度使活菌数达到108CFU/mL作为后续试验用菌悬液。

　　1.2.4最 小 抑 菌 浓 度 (MIC)和 最 小 杀 菌 浓 度(MBC)测定使用杭州天和微生物试剂有限公司生产的恩诺沙星药敏纸片,采用K-B纸片琼脂扩散法,以大肠埃希菌ATCC 25922为质控,按照CLSI标准方法进行药敏试验及结果判定[5]。在药物敏感定性检测的基础上,参考戴自英等试管二倍稀释法[6-8]进行MIC的测定。将乳酸恩诺沙星药物母液稀释2倍(1 000μg/mL)之后加入到第1支试管,再进行2倍稀释加入到第2支试管,以此类推直至稀释到1 000μg/mL~0.25μg/mL的13个浓度梯度。

　　取15支无菌带塞试管分别编号1号~15号,每支试管装有TSB培养基4.0mL,1号~13号试管加入不同浓度的药液0.5mL,14号试管加0.5mL无菌水,15号试管加1mL的TSB培养基,将1号~14号试管各加入0.5mL浓度为108CFU/mL的菌液,使细菌的终浓度约为107CFU/mL,而培养基中的药 液 浓 度 达 到100μg/mL~0.025μg/mL,28℃恒温培养24h,观察无明显细菌生长的试管对应的最低药物浓度即为MIC。培养48h,取MIC上无明显细菌生长的各个药液浓度的菌液0.1mL均匀涂布于TSA培养基,28℃恒温培养24h,菌落数小于5个的作为该药物的最小杀菌浓度(MBC)[6],测定重复5次。

　　1.2.5乳酸恩诺沙星对A.sobria生长的影响取处于对数生长期的菌悬液进行接种,按照5%的接种量将菌悬液接种于100mL液体培养基中,28℃、150r/min恒温摇床培养。分别于0h~13h期间每间隔1h取样1次,分光光度计测定OD600nm值。

　　以时间为横坐标,OD值为纵坐标绘制A.sobria的生长曲线。

　　在检测A.sobria生长曲线的基础上,研究乳酸恩诺沙星对A.sobria生长的影响。设置3个试验组 和1个 对 照 组,每 组 按5%的 接 种 量 接 种A.sobria,其中对照组于0h加入1mL无菌水,试验组分别在接种后培养的第0、1、5h加入乳酸恩诺沙星药液,使乳酸恩诺沙星的最终浓度达到MIC值[3,7]。28℃、150r/min恒温摇床培养,分别于0h~13h每间隔1h取样,分光光度计测定OD600nm值,以时间为横坐标,OD600nm值为纵坐标绘制生长曲线。

　　1.2.6乳酸恩诺沙星对A.sobria的杀菌动力学①配制乳酸诺氟沙星20×MIC、40×MIC、80×MIC的药物浓度。取盛有4mL无菌TSB的试管4支,编号为A、B、C、D,其中A、B、C中分别加入浓度为20×MIC、40×MIC、80×MIC乳酸恩诺沙星药液0.5mL,D组为4.5mL无菌TSB的对照组,然后,向4支试管中分别加入0.5mL处于对数生长期的菌悬液,使得 药物终浓 度分别达到2× MIC、4×MIC、8× MIC,每 个 浓 度 设3个 平 行。

　　28 ℃、150r/min恒温摇床培养,分别在0、3、6、9、12h取0.1mL的培养液,用无菌生理盐水对菌悬液进行10倍系 列 稀 释,取 稀 释 度104~106的 稀 释 液 各0.1mL置于TSA平板均匀涂布,每个稀释度3个平板,28 ℃恒温培养24h后,对细菌数在30~300间的平 板 进 行 计 数,取 其 平 均 值,计 算 活 菌 数(CFU/mL)。以时间为横坐标,每毫升菌液中活菌数(CFU/mL)的对数(lg)为纵坐标,建立乳酸恩诺沙星对A.sobria的杀菌动力学曲线[9]。

　　1.2.7乳酸恩诺沙星对A.sobria的体外抗菌后效应(PAE)参考苏振霞等[9]的方法稍加改进,设置试验管T和对照管C。取5只无菌的试管分别编号为T1、T2、T3、C1、C2,其中T1、T2、T3为试验组,C1、C2为对照组。试验组每支试管加入4mL无菌TSB,分别加入0.5mL的20×MIC、40×MIC、80×MIC乳酸恩诺沙星药液,对照组为4.5 mL无菌TSB,再向各试管中加0.5mL浓度为108CFU/mL的菌悬液,使T1、T2、T3试管中药物的终浓度分别为2× MIC、4× MIC、8× MIC。 置 于28 ℃、150r/min条件下恒温振荡培养。

　　培养2h后,采用100倍稀释除药法,取上述各试验管及对照管中的菌液0.1mL分别加入到5支装有9.9mL、28 ℃预温的TSB试管中,C2中加入适量的乳酸恩诺沙星药液,使药物终浓度为0.08×MIC,作为残留药物造成PAE的对照组。以上各管混匀后立即进行28℃、150r/min恒温振荡培养,此时计作0h,分别在0、2、4和6h取0.1mL菌液适当稀释后,涂布TSA平板,进行细菌计数,重复3次,取平均值。将各时间点的细菌浓度值(CFU/mL)取对数(lg CFU/mL)后作为为纵坐标,以时间(h)为横坐标作图,建立对照管及试验管细菌重建后恢复生长的动力学曲线。

　　由细菌生长动力学曲线计算T、C,其中,T和C分别为试验管和对照管细菌浓度CFU/mL高于重建后零时10倍所需时间(h),按照PAE=T-C的公式计算PAE值[10-11]。

　　2 结果

　　2.1 乳酸恩诺沙星对A.sobria的MIC和MBC使用

　　K-B纸片琼脂扩散法检测结果显示,恩诺沙星对A.sobria敏感(抑菌圈直径40mm),采用二倍稀释法测得乳酸恩诺沙星对A.sobria的MIC为0.39μg/mL,MBC为1.56μg/mL,计算出MBC/MIC为4。

　　2.2 乳酸恩诺沙星对A.sobria生长的影响

　　在28℃、150r/min恒温摇床培养条件下,A.sobria的生长曲线如图1所示,1h之前是短暂的延滞期,1h后进入对数生长期,大约11h后进入稳定期。【1】

　　在接种A.sobria培养后0、1、5h3个不同的时间点分别向试验组加入乳酸恩诺沙星药液,使培养液中最终药物浓度为1×MIC,药物处理后1bria的生长曲线如图2所示。结果表明,在不同生长时期进行药物处理具有不同的影响,在0h接种同时加入乳酸恩诺沙星,药物对A.sobria的生长有明显的抑制作用,对照组在11h后进入稳定期,而0h药物处理组在培养4h左右进入稳定期;培养1h后的药物处理组,细菌增长速率低于对照组,在加入药液2h后生长减慢,进入稳定期;培养5h后加入恩诺沙星的处理组,在加入药物1h之后,细菌增长速率较对照组降低,在添加药物4h后进入稳定期。

　　图2显示,在A.sobria生长的延滞期加入乳酸恩诺沙星,药物对该菌的生长有强抑制作用。而在对数生长期加入药物,其抑制作用较延滞期低。【2】

　　
　　2.3 乳酸恩诺沙星对A.sobria的体外杀菌作用

　　乳酸恩诺沙星以2×MIC、4×MIC、8×MIC作用后,对A.sobria的体外杀菌作用如图3所示。从图3可以看出,细菌与药物接触后,数量开始减少,在3h~12h内显示出随药物浓度的增加,杀菌效果增强的浓度依赖性规律。【3】

　　
　　2.4 乳酸恩诺沙星对A.sobria的抗菌后效应

　　乳酸恩诺沙星以2×MIC、4×MIC、8×MIC的药物浓度对A.sobria接触2h后,体外抗菌后效应结果见表1,除去药物后细菌的恢复生长情况见图4。

　　由表1可知,随着药物浓度的升高,PAE值增大,呈现浓度依赖性。由图4可以看出药物残留对照C2与空白对照C1的生长曲线几乎相同,而C1和C2的活菌数高于2×MIC、4×MIC和8×MIC实验组,试验组细菌数随着药物浓度的的增加而减少。在相同试验条件下,高浓度药物组对A.sobria的抑制效果高于低浓度组。【4】

　　
　　3 讨论

　　3.1 乳酸恩诺沙星对A.sobria的敏感性

　　乳酸恩诺沙星对A.sobria的MIC、MBC的相关报道较少。王志强等[3]研究氟喹诺酮类药物对A.sobria的体外药效时的结果显示,盐酸恩诺沙星对A.sobria的MIC为0.025mg/L,MBC/MIC为2。樊海平等[10]研究盐酸恩诺沙星的药物效应时,得出其对A.sobria的MIC、MBC均为0.048 8mg/L。

　　樊海平等总结了国内外关于恩诺沙星对水产致病菌的体外抑菌试验,认为恩诺沙星对敏感病原微生物如气单胞菌等的MIC小于0.1mg/L。而本试验结果乳酸恩诺沙星对A.sobria的MIC和MBC与上述文献报道相比数值偏大,可能由于试验所用菌株为临床分离株,在生产中长期使用抗菌药物控制疾病,导致病原菌对抗菌药物的敏感性下降而使MIC和MBC值升高。此外,不同研究者得到的研究结果的差别,也可能与所使用的药物来源、菌株来源、培养基成分差异,试验中菌液的使用浓度不同等因素有关[11]。

　　乳酸恩诺沙星对A.sobria有较好的抑菌杀菌效果,作用效果在细菌生长的不同时期有差异。在延滞期加入乳酸恩诺沙星,对A.sobria的生长具有较强抑制作用,而在对数生长期加入药物,其抑制作用较延滞期相对较弱。因此在防治由A.sobria引发的疾病时,及早用药对疾病的控制和治疗非常重要。

　　本研究结果显示乳酸诺氟沙星的杀菌效果随药物浓度的增加而增强,表现较强的浓度依赖性,结果与马寅等[12]、徐丽娟等[13]等研究的药物对细菌杀菌曲线的规律是一致的。过低浓度的药物对病原菌没有抑菌或杀菌作用,长期使用还会引起细菌产生耐药性[14]。因此,生产中应注意乳酸恩诺沙星的使用浓度,避免长期低剂量使用抗菌药物进行鱼病防治。

　　3.2 乳酸恩诺沙星的体外PAE

　　PAE又称抗菌后效应,是指细菌和抗菌药物短暂接触,当抗菌药物被清除或下降至MIC以下时,在一定时间内细菌生长仍受到持续抑制的效应[9]。

　　PAE已成为评价抗菌药物药效学的重要参数。本研究中乳酸恩诺沙星对A.sobria的PAE,显示出随药物浓度增加PAE值增大的浓度依赖性的规律,和徐丽娟等[13]研究恩诺沙星对A.hydrophila的PAE的结果相一致。兽医临床对氟喹诺酮类药物的研究结果也显示,氟喹诺酮类药物抑、杀菌作用在很大范围内呈剂量依赖关系[13]。药物体外PAE的试验结果可能与多种因素有关:①菌种及其接种量:同一种药物在体外的PAE因菌种的不同而不同,而在一定的药物浓度下,接种量越大,残存的细菌越多,恢复生长就相对较快,PAE缩短;②药物浓度:PAE值随药物浓度增加而增大;③药物与细菌的接触时间:接触时间越长,PAE越大;④其他因素:药物的联合作用、pH、温度、培养基等也会对药物的体外PAE产生影响。

　　按照传统观念,抗菌药物需维持1×MIC以上浓度,方能发挥疗效,当血药浓度低于1×MIC时应再次给药[15]。本研究中乳酸恩诺沙星的PAE结果显示,乳酸恩诺沙星和A.sobria同培养2h后除去药物,其抑菌作用并没有消失。由于PAE的存在,即使乳酸恩诺沙星浓度低于MIC,仍可以持续发挥抗菌作用。目前,恩诺沙星在水产上的应用越来越广,为防止药物滥用所造成的药物残留,减少药物对养殖水环境的污染以及耐药菌的出现,在制定给药方案时,可考虑以血药浓度高于1×MIC的时间与PAE的时间之和作为给药间隔,或者减少给药次数,在满足疗效的基础上,降低临床上可能出现的毒副作用,达到高效、安全的治疗目的。

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　　[4] 杨先乐,陆承平,战文斌.新编渔药手册[M].北京:中国农业出版社,2005:183-184.